Оценка разработанной модели экспериментального ринита у лабораторных крыс: доклиническое экспериментальное рандомизированное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Воспаление, возникающее в слизистой оболочке (СО) верхних дыхательных путей в ответ на воздействие разнообразных повреждающих факторов, является защитно-приспособительной реакцией организма, которая характеризуется развитием альтеративно-дистрофических, сосудисто-экссудативных и пролиферативных реакций. Среди повреждающих факторов, воздействующих на мукоцилиарную систему (МЦС) полости носа, особую актуальность в практике оториноларинголога (ЛОР-практике) имеют патогенная флора, травма, в частности операционная, и химический фактор (длительное бесконтрольное воздействие медикаментозных препаратов на СО носа) [1–5].

Определенные трудности в клинике возникают при оценке состояния регенерации МЦС, так как применение прижизненного морфологического исследования СО носа у пациентов травматично. Поэтому весьма актуальным для изучения состояния МЦС остается разработка моделей экспериментальных ринитов на лабораторных животных [6–10].

При анализе литературных данных обращает на себя внимание, что в структуре факторов, вызывающих экспериментальный ринит, преобладает химический фактор с последующим введением патогенной флоры, что связано с тем, что одним из актуальных вопросов экспериментальной фармакологии в отношении дыхательной системы являются инфекционные (гнойные) заболевания. Экспериментальные риносинуситы вызывались введением в носовую полость и околоносовые пазухи носа растворов формалина, нашатырного спирта, взвеси вирусов и бактерий [11–17].

Однако в связи с интенсивным развитием малоинвазивной хирургии актуальным остается вопрос изучения основных звеньев патогенеза нарушений регенерации МЦС носа при воспалительной реакции СО после оперативных вмешательств. На сегодня недостаточно изучен характер патоморфологических изменений СО в процессе заживления, а также основные причины нарушения репарации, способствующие стойкой морфологической трансформации СО [18–25]. На наш взгляд, оптимальным решением данной проблемы может стать разработка и использование методик экспериментального ринита у лабораторных животных.

Цель исследования — разработать и оценить модель экспериментального ринита у лабораторной крысы путем изучения клинических, морфологических и биохимических изменений при воспалительном процессе.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Экспериментальное исследование проведено на 60 половозрелых крысах-самцах линии Wistar, массой 250–300 г, полученных из вивария государственного учреждения Луганской Народной Республики «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки» (ГУ ЛНР «ЛГМУ им. Святителя Луки»).

Размещение и содержание

Животные содержались в условиях вивария с обеспечением стандартных условий: 12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, стандартный пищевой и водный рацион, температурный режим 18–25 °C. Содержание и проведение экспериментов осуществлялось в соответствии с нормативными документами: Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199 н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (утвержден Приказом Федерального агентства по техрегулированию и метрологии № 1700-ст от 20 ноября 2014 г.), Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, European Conventionforthe Protectionof Vertebrate Animals Usedfor Experimentalandother Scientifi c Purposes (ETS 123), Strasbourg, 1986.

Дизайн исследования

Было проведено рандомизированное контролируемое исследование. Сравнивались две группы: экспериментальная группа (n = 30) — крысы, у которых выполнялось моделирование экспериментального ринита, и контрольная группа (n = 30), интактные животные. Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Исследование выполнялось на базе лаборатории кафедры физиологии ГУ ЛНР «ЛГМУ им. Святителя Луки». Морфологические исследования были проведены в отделении патогистологии и иммуногистохимии общества с ограниченной ответственностью (ООО) «Молекулярная диагностика плюс» г. Луганска.

Объем выборки

Было обследовано 70 крыс-самцов, из них 7 не соответствовали критериям включения. Оставшихся животных распределили на две группы: экспериментальная группа 1 (n = 32) — крысы, у которых выполнялось моделирование экспериментального ринита, и группа 2 (n = 31), контрольная, интактные животные. В экспериментальной группе 2 животных (из-за осложнений после наркоза) и 1 животное в контрольной группе (из-за нанесения себе случайной травмы) не закончили протокол исследования в полном объеме.

Критерии включения и исключения

Критерии включения

В исследование включались только самцы крыс массой 250 ± 50 г в возрасте от 6 месяцев до года; без видимой патологии развития и признаков заболеваний.

Критерии невключения

В эксперимент не включались животные, вес которых отличался более чем на 50 г, возраст менее 6 месяцев и более 1 года, с заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей, а также не включались особи женского пола.

Критерии исключения

Развитие у животных осложнений после наркоза, нанесение себе дополнительной произвольной травмы и развитие гнойных осложнений нижних дыхательных путей после травмы носа.

Рандомизация

Рандомизация проводилась методом «конвертов».

Обеспечение анонимности данных

При оценке результатов и анализе полученных данных информацией о распределении животных на группы владел только руководитель исследования.

Итоговые показатели (исходы исследования)

Итоговыми показателями, позволившими провести оценку разработанной модели экспериментального ринита, явились изменения лейкоформулы крови, С-реактивного белка (СРБ), морфологическая верификация воспалительной реакции СО на макро- и микропрепаратах носовой перегородки.

Экспериментальные процедуры

Травма СО полости носа наносилась под эфирным наркозом (из расчета 3–5 мл на 1 кг веса) через маску в смеси с атмосферным воздухом. Для травмирования СО полости носа использовали крючок из набора для микроскопических операций на ухе.

Инструмент вводили в каждую ноздрю на глубину до 1,5–1,8 см, развернув крючком к носовой перегородке, и производили линейный разрез на перегородке носа поступательным движением кпереди.

Экспериментальное вмешательство на лабораторных животных проводилось в асептических условиях.

В ходе исследования проводился ежедневный внешний осмотр животных, регистрировались признаки ринита. Для подтверждения развития воспалительной реакции у животных контрольной и экспериментальной групп исследовали лейкоформулу и С-реактивный белок крови методом латекс-усиленной иммунотурбидиметрии. Для изучения морфологических изменений производился забой животных, забор СО носовой перегородки. Полученные образцы фиксировали в 10% растворе формалина, осуществляли проводку в спиртах с возрастающей концентрацией и заливку в парафин. С каждого блока с тканью СО носовой полости животного изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование выполнялось при увеличении ×100, ×400 с помощью микроскопа PrimoStar (CarlZeiss, ФРГ).

Забор крови, материала для гистоморфологического исследования проводили на 2, 5 и 10-е сутки. Подготовка и оценка микропрепаратов проводилась в течение двух недель.

Уход за животными и мониторинг

Наблюдение за состоянием животных после нанесения травмы носовой перегородки производилось в течение 10 дней. Во время проведения исследований животные имели свободный доступ к пище и воде. В соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22 сентября 2010 г. животных эвтаназировали помещением в СО₂-камеру, в условиях постепенного заполнения камеры диоксидом углерода. Данный вид эвтаназии животных сопровождается минимумом боли, страдания и дистресса.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Предварительный расчет выборки не производился.

Статистические методы

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft, Inc., США). Гипотеза нормальности распределения в выборках проверялась с помощью критерия W Шапиро — Уилка. Описание количественных данных отличного от нормального распределения проводили с помощью медианы (Me), интерквартильного размаха (25 процентиль / 75 процентиль). Различия между количественными параметрами независимых групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна — Уитни, между зависимыми группами — критерия Вилкоксона. Различия во всех случаях считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В контрольной группе крыс при забое СО перегородки носа была розовая, без отека, влажная, покрыта прозрачным слизистым секретом (рис. 2).

При гистологическом исследовании также не отмечалось признаков ее воспаления, травмы: цельный реснитчатый эпителий на всем протяжении с четко визуализированными реснитчатыми, базальными и бокаловидными клетками, базальной мембраной и собственной соединительнотканной пластинкой (рис. 3).

Непосредственно после нанесения травмы у крыс экспериментальной группы отмечалось кратковременное необильное носовое кровотечение. На 2-е сутки после травмы при забое в полости носа крыс отмечалось мутное геморрагическое отделяемое, сгустки крови, СО перегородки носа с кровоизлияниями, выраженной инъекцией сосудов, отечна, покрыта геморрагическим экссудатом, определяется линейный дефект носовой перегородки (рис. 4).

На микропрепаратах определяется десквамация и некроз эпителия, кровоизлияния, утолщение субэпителиального слоя за счет отека и нейтрофильной инфильтрации (рис. 5).

На вторые сутки после травмы в крови крыс отмечалось достоверное увеличение уровня СРБ — 0,67; 0,65/0,73 мг/дл в сравнении с контрольной группой — 0,35; 0,35/0,43 мг/дл, увеличение сегментоядерных нейтрофилов и уменьшение лимфоцитов в лейкоформуле (табл.).

Начиная с 3–4-х суток эксперимента у всех крыс в группе 1 наблюдались симптомы острого ринита в виде выделения из ноздрей слизистого или слизисто-гнойного секрета, чихания, хрюканья носом, что сопровождалось периодическим расчесыванием носа.

На 5-й день эксперимента в полости носа крыс определялся вязкий слизисто-гнойный секрет, слизистая оболочка перегородки носа гиперемирована, отечна (рис. 6).

При микроскопическом исследовании на 5-й день нарастают воспалительные изменения: десквамация реснитчатого эпителия и инфильтрация нейтрофильными лейкоцитами, лимфоцитами с примесью макрофагов отмечается на более обширных участках. Базальная мембрана отечна, наблюдается диффузное утолщение субэпителиального слоя за счет нейтрофильной инфильтрации клеток (рис. 7).

В крови крыс экспериментальной группы на 5-й день эксперимента продолжает нарастать уровень СРБ — до 1,220; 1,150/1,230 мг/дл (р < 0,05). Также отмечается повышение уровня палочкоядерных нейтрофилов до 7; 7/7%, сохраняется повышенный уровень сегментоядерных нейтрофилов (42; 39/44%) в сравнении с контрольной группой 33; 32/33%, отмечается снижение лимфоцитов до 45; 40/47% (контроль — 59,5; 55/60%).

К 10-му дню у крыс после травмы дефект на перегородке носа за счет уменьшения отека выглядит более четко, слизистая оболочка в сравнении со 2-м днем более бледная, дефект очищается от детрита. Отделяемое из носа слизистого или слизисто-гнойного характера (рис. 8).

На микропрепаратах отмечаются признаки пролиферации (участки недифференцированного регенерирующего эпителия) на фоне субэпителиальной воспалительной инфильтрации нейтрофилами, макрофагами, лимфоцитами. Базальная мембрана отечна, отмечается полнокровие сосудов (рис. 9).

В крови крыс экспериментальной группы 1 на 10-й день сохраняются признаки воспалительного процесса: повышен уровень СРБ (1,900; 0,457/4,325 мг/дл), сдвиг лейкоформулы влево: повышен уровень палочкоядерных нейтрофилов — 4; 2/6% (в контрольной группе –1,5; 1/2%), статистически значимо в сравнении с 5-м днем эксперимента продолжается повышение сегментоядерных нейтрофилов до 54; 48/56%.

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация / научная значимость

После травмы у крыс в экспериментальной группе 1 развивается острый ринит, который клинически проявляется выделением из ноздрей слизистого или слизисто-гнойного секрета, чиханием с расчесыванием носа. В крови в сравнении с контрольной группой отмечается повышение уровня СРБ, палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, снижение лимфоцитов. На макро- и микропрепаратах СО носовой перегородки на 2-е, 5-е сутки после травмы регистрируется выраженная воспалительная реакция.

Ограничения исследования

Ограничения исследования определены форматом эксперимента (мелкие лабораторные животные, модель посттравматического ринита, сроки выведения из эксперимента), что следует учитывать при воспроизведении аналогичных исследований для разработки методов лечения повреждения СО.

Обобщаемость / экстраполяция

На сегодня актуально изучение характера патоморфологических воспалительных изменений СО после хирургических вмешательств в полости носа, причины нарушения ее регенерации. Полученные нами экспериментальные данные коррелируют с результатами, полученными другими авторами при моделировании экспериментальных ринитов у лабораторных животных: на 2-е сутки отек и инфильтрация нейтрофилами субэпителиального слоя, появление на 5-й день инфильтрации СО моноцитами [19][20]. На 10-е сутки нами установлено появление недифференцированного регенерирующего эпителия, в то время как те же авторы отмечают формирование грануляционной ткани уже с 5-го дня, с 10-го дня начало регенерации бокаловидных и мерцательных клеток. Недостатком моделей воспаления СО после применения химических веществ, по нашему мнению, является ее ожог, приводящий к сильным деструктивным изменениям, что не позволяет адекватно оценивать репаративные функции СО.

Данная разработанная модель экспериментального ринита у лабораторной крысы позволяет получить объективную характеристику последовательности функциональных и структурных нарушений на всех стадиях воспалительного процесса СО полости носа после хирургической травмы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования показали, что была получена адекватная экспериментальная модель острого ринита у лабораторных животных. Клинические проявления и изменения в показателях крови характерны для острого воспалительного процесса. У экспериментальных животных после нанесения хирургической травмы в СО перегородки носа развиваются характерные деструктивные и репаративно-пролиферативные процессы.

Микроскопическая характеристика изменений СО носовой перегородки показала, что острая фаза экссудативного воспаления развивается на 2-е сутки: на фоне очагов некроза эпителия наблюдается полнокровие сосудов, отек, нейтрофильная воспалительная инфильтрация подслизистого слоя. К 5-м суткам в воспалительном инфильтрате возрастает доля лимфоцитов и макрофагов, к 10-м наблюдаются начальные признаки восстановления целостности эпителиальной ткани — появление недифференцированного регенерирующего эпителия.

Предложенная нами экспериментальная модель ринита у крыс легко воспроизводима, патоморфологически верифицирована, дает возможность динамического наблюдения за состоянием МЦС после хирургического вмешательства, позволяет оценить эффективность терапевтического воздействия на регенерацию СО носовой полости.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Регистрация протокола

Протокол исследования был составлен до начала исследования, одобрен на заседании кафедры физиологии, а также комиссией по вопросам биоэтики ГУ ЛНР «ЛГМУ им. Святителя Луки».

Доступ к данным

Доступ к данным ограничен авторскими правами.