Посмертные изменения тканей и динамика их импедансометрических показателей: доклиническое экспериментальное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Установление происходящих в посмертном периоде закономерностей является одной из главных проблем судебно-медицинского учения о смерти и трупных явлениях [1]. Познание этих закономерностей непосредственно связано с реконструкцией условий посмертного периода и, следовательно, определением давности наступления смерти (ДНС).

Наиболее полно изучены ранние посмертные изменения, развивающиеся в сроки до 72 часов с момента наступления смерти. Количество исследований, направленных на изучение гнилостно измененных трупов, значительно меньше, чем количество аналогичных исследований гнилостно неизмененных трупов [2]. Недостаточная изученность и противоречивость критериев определения ДНС в поздние сроки посмертного периода и сложившаяся практика ограниченного использования нетрадиционных (инструментальных) методов, в частности биофизических, показывают острейшую актуальность данного направления исследования и в то же время трудность научно-практической реализации [3]. Так, импедансометрический подход к определению ДНС базируется на фундаментальных биофизических процессах, которые протекают в биологических тканях и характер которых определяется биохимическим состоянием объекта. Метод импедансометрии высокочувствителен и позволяет регистрировать объективные данные. Преимуществами метода являются доступность необходимого оборудования и простота методики, позволяющие использовать его как средство экспресс-диагностики, подкрепляя инструментально традиционные методы анализа трупных явлений.

Основой диагностики ДНС были и останутся ранние и поздние трупные изменения, а лабораторные методы, по крайней мере, на современном этапе их разработки, следует рассматривать в качестве дополнительных. Изуче­ние последовательных трансформаций тканей трупа в процессе его разложения и их взаимосвязи с изменениями его микробиологических, энтомологических, биофизических характеристик являются основой для разработки дополнительных инструментов определения ДНС [4–8]. Ранние и поздние трупные изменения, то есть посмертные изменения, их динамика должны рассматриваться и с точки зрения общего биологического процесса, а пока «порядка» в стадиях разложения трупа (ни с общебиологической, ни с судебно-медицинской точки зрения) нет. В аспекте практических целей судебно-медицинской экспертизы представляется целесообразной периодизация на основе патоморфологии разложения тканей трупа с пониманием причин смены тех или иных стадий и, соответственно, методов диагностики давности наступления смерти. Также следует учитывать, что процесс разложения мертвых тел зависит от ряда факторов, особенно связанных с воздействием на мертвое тело климатических и геофизических условий, физических свойств почвы и воды, а также возможностью доступа к трупу некрофильных насекомых [9] и позвоночных-падальщиков.

Наиболее рациональным представляется комплексный подход к изучению вопроса установления ДНС: накопление сведений о качественных и количественных характеристиках и закономерностях разложения мертвого органического вещества, установление закономерностей изменения количественных параметров от срока ДНС. Такой подход в перспективе позволит начать разработку компьютерной системы, способной не только выполнять однажды запрограммированную последовательность действий над известными судебно-медицинским экспертам данными, но и самой анализировать вновь поступающую информацию и находить в ней закономерности.

Цель исследования — анализ посмертных изменений тканей трупов и динамики их импедансометрических показателей в условиях естественного биоценоза.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Исследованы модельные биообъекты — трупы свиней мужского пола, в возрасте одного-двух месяцев, весом до 10 кг. Трупы были получены со скотобойни фермерского хозяйства, где животных забили традиционным способом, без повреждений кожных покровов.

Размещение и содержание

В связи с особенностями исследования размещение и содержание животных не проводилось.

Дизайн исследования

Доклиническое экспериментальное исследование выполнено на трупах свиней, находящихся в условиях естественного биоценоза. Продолжительность исследования — 28 суток, кратность — ежедневно. В процессе биологических исследований фиксировались и анализировались изменения тканей трупов при их разложении. Предметом биофизических исследований являлись показатели импеданса тканей трех диагностических зон каждого трупа: кожно-мышечного лоскута, хрящевой части третьего ребра и пяточного сухожилия. Проводился анализ динамики абсолютных значений и коэффициента дисперсии импеданса в зависимости от срока давности наступления смерти. Блок-схема дизайна исследования представлена на рисунке 1.

Объем выборки

Исследованы трупы восьми свиней.

Критерии соответствия

Критерии включения

Животные мужского пола, массой 9–10 кг, без видимых повреждений и проявлений заболеваний, известная дата наступления смерти (не более суток), наличие только ранних трупных явлений.

Критерии невключения

Животные женского пола, масса менее 9 и более 10 кг, наличие поздних трупных явлений.

Рандомизация

Эксперимент проведен в двух повторностях: с 20 июня по 18 июля 2022 г. (период I, 4 трупа), и с 8 июля по 5 августа 2022 г. (период II, 4 трупа). Отбор животных осуществлялся на ферме случайным образом согласно критериям включения в исследование.

Обеспечение анонимности данных

Проведение эксперимента, оценка результатов и анализ полученных данных осуществлялись без введения дополнительных лиц.

Итоговые показатели (исходы исследования)

Проводилась фиксация и анализ изменений тканей трупов и влияния биотических и абиотических факторов с установлением стадийности процессов разло­жения.

Выполнены измерения величины импеданса Z для каждого срока ДНС на пяти частотах тока исследования: 100 и 120 Гц, 1, 10 и 100 кГц для трех диагностических зон каждого биообъекта. Всего снято 2400 показаний. Для оценки характера дисперсии Z мы использовали коэффициент дисперсии k_д = Z_нч/Z_вч, где Z_нч — импеданс на низкой частоте (100 Гц), Z_вч — импеданс на высокой частоте (100 кГц) и коэффициент поляризации k_п = Z (10 кГц)/Z (100 кГц).

Экспериментальные процедуры

Условия проведения исследования

Исследования проведены на территории садовых посадок частного сектора летом 2022 года. Характеристика района исследования представлена в таблице 1.

Приманки выкладывали на верхний почвенный слой на расстоянии более 25 м друг от друга с целью ограничения взаимного влияния. Для сохранности трупов на месте и ограничения воздействия некробионтов их защищали с помощью клеток из мелкоячеистой металлической сетки.

Показатели основных абиотических факторов среды на момент отбора проб приведены в таблице 2.

Экспериментальные процедуры

Наблюдение изменений тканей трупов модельных биообъектов, пребывавших в условиях естественного биоценоза, проводилось на протяжении 28 дней исследования. Зафиксированы характерные изменения мягких тканей трупов в процессе протекания двух стадий разложения.

Импеданс измеряли прибором Keysight U1731 (бренд/производитель: Keysight Technologies (США), страна происхождения: Малайзия). Выбор прибора обусловлен его портативностью, мобильностью и простотой в использовании. Прибор имеет 2 датчика в виде игл из нержавеющей стали диаметром 0,5 мм и длиной погружной части 5 мм. Датчики жестко фиксировали на расстоянии 5 см друг от друга. При снятии показаний датчики вводили в ткань диагностической зоны на всю длину погружной части (5 мм) путем прокола. Измерения импеданса проводили на 5 частотах (100 и 120 Гц; 1, 10 и 100 кГц). Выбор частот определялся анализом данных литературы [10] и возможностями измерительного прибора.

Измерение импеданса проводили на трех диагностических зонах трупа: хрящевая часть III ребра, кожно-мышечный лоскут плеча и пяточное сухожилие. При выборе диагностических зон руководствовались требованиями доступности ткани для исследования и максимального снижения влияния индивидуальных особенностей биообъекта на измерение. Зона «кожно-мышечный лоскут» имеет удобное расположение и легко исследуется. Для каждого нового измерения в кожно-мышечном лоскуте производили новые проколы в связи постоянным контактом диагностической зоны с внешней средой и подсыханием краев проколов. При измерениях импеданса хряща требовался кожный разрез. Для доступа к сухожилию делали вертикальный разрез длиной 5 см в проекции пяточного сухожилия (tendo calcaneus). Диагностические зоны «хрящ» и «сухожилие» также имеют удобное расположение, их легко исследовать, а вводимые в их ткань иглы датчика не задевают другие ткани и органы. После снятия показаний эти области легко закрываются кожей во избежание постоянного контакта внешней средой, подсыхания и изменения протекания процесса гниения. Для каждого нового измерения иглы датчика вводили в проколы, оставшиеся от предыдущего измерения.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Предварительный расчет выборки не производился.

Методы статистического анализа данных

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft, США). Числовыми характеристиками выборки из 8 биообъектов являются медианные значения величины импеданса Z и коэффициентов k_д и k_п, значения нижнего и верхнего квартилей. Различия между количественными параметрами, соответствующими разным срокам ДНС, оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для зависимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент проводился на трупах модельных биообъектов [11][12], пребывавших в условиях естественного биоценоза. Прослежены две стадии разложения мягких тканей трупов модельных биообъектов, которые условно можно обозначить как «преимущественно микробиологическая», а затем «микробно-зоологическая» утилизация.

Преимущественно микробная деструкция является первой стадией [13], начинающейся с наступления биологической смерти и заканчивающаяся с появлением гнилостной эмфиземы. В эту стадию в трупах преобладает бактериальная жизнедеятельность, приводящая к постепенному разрушению трупных тканей. При наружном осмотре эта стадия делится на два этапа: неизмененного или «свежего» трупа — без гнилостных изменений и этап, когда гнилостные изменения заметны наблюдателю — конец первых суток, начало вторых — появляется трупный запах и зеленоватый цвет кожи живота.

Трупный запах появляется в результате жизнедеятельности микроорганизмов, прижизненно населяющих кишечник организма. Микробы выделяют множество газов, увеличивая объем как кишечника, так и брюшной полости в целом — живот раздувается и брюшная стенка становится напряженной. Одним из этих газов является сероводород, вступающий в реакцию с миоглобином и гемоглобином, в результате которой образуются сульфгемоглобин и сульфмиоглобин, изменяющие цвет кожных покровов в грязно-зеленый. Эти явления хорошо заметны уже ко вторым суткам наблюдения.

С появлением некрофильных — питающихся омертвевшими трупными тканями — насекомых начинается вторая стадия [14–17]. В наших наблюдениях эта стадия начинается с 4–5 суток срока ДНС. Увеличивающийся объем гнилостных газов в эту стадию продолжает «раздувать» труп, сглаживая визуально переход головы к туловищу, язык начинает выступать из полости рта, а глазные яблоки — из глазниц. Из полости рта и носа подтекает гнилостного вида грязно-бурая жидкость, а из начинающего зиять заднепроходного отверстия выделяются каловые массы. На ощупь можно ощутить гнилостную эмфизему в виде «похрустывания» мягких тканей. Половые органы мужских особей заметно увеличивались в объеме. Кожа приобретает грязно-зеленоватый цвет уже повсеместно, в виде грязно-бурых полос становится отчетливо видна гнилостная венозная сеть. Поверхностные слои кожи отслаиваются в виде заполненных буро-красной жидкостью пузырей, впоследствии рвущихся и обнажающих более глубокие слои кожи. Дальнейшее увеличение объема гнилостных газов приводит к разрывам кожи живота и выпадению через них петель кишечника. К концу второй — началу третьей недели мягкие ткани трупа становятся осклизлыми и легко рвутся при ощупывании. Мягкие ткани постепенно изменяются, принимая вид однородной зловонной вязкой массы, «сползающей» с подлежащих костей. Аналогичным же образом происходит изменение внутренних органов. На четвертой неделе труп становится доступен воздействию окружающей среды полностью — гнилостных газов в мягких тканях не остается, сами мягкие ткани окончательно приняли бесструктурный вид, начал оголяться скелет.

В течение всего этого времени, несмотря на попытки защиты приманки от проникновения взрослых особей мух и откладывания ими яиц, фиксировалось появление насекомых-некробионтов. Наличие на трупе двукрылых приводит к ускорению темпа деструкции мягких тканей трупа. Появившиеся личинки двукрылых благодаря выделению пищеварительных ферментов проделывают в мягких тканях трупа отверстия, через которые активно перемещаются, что дополнительно способствует разрушению трупа. Через два-три дня после двукрылых на трупе фиксировалось появление жесткокрылых, сменяющих видовой состав в процессе дальнейшего разложения трупа. Появление жуков связано как непосредственно с состоянием мягких тканей, так и с появлением других насекомых, являющихся их пищей.

В целом на этой стадии трупная экосистема наиболее богата: здесь активны микробы и насекомые, кроме того, труп интересен и для позвоночных-падальщиков. Микробы в эту стадию пассивно «перемешиваются» — посещающие труп мухи приносят «новые» бактерии и уносят «старые». Вследствие разжижения мягких тканей они вытекают наружу на почву, вследствие чего все большее количество танатомикробиома можно обнаружить в подлежащей почве. Яйца и личинки мух привлекают на труп пожирающих их муравьев, клещей, ос и пауков, хищников-жуков. Для этой стадии, продолжающейся до 1,5–2 месяцев (в зависимости от размеров и массы трупов), характерно быстрое уничтожение некробионтами основной массы мягких тканей объекта. Следует отметить, что временная последовательность биологических изменений для периодов I и II совпадает по срокам ДНС, несмотря на некоторые отличия показателей основных абиотических факторов среды на момент наблюдения (табл. 2).

В рамках биофизических исследований были проведены измерения импеданса Z, и для тканей всех исследуемых диагностических зон наблюдаются следующие характерные закономерности:

1. На всех частотах тока исследования зависимость Z от срока ДНС идентичная: можно выделить начальный интервал 0–4 суток, где Z дает «всплеск» с дальнейшим более плавным уменьшением. На рисунке 1 представлены временные зависимости Z на частоте 1 кГц для всех исследуемых тканей в условиях естественного биоценоза. Измерения Z в течение всего периода наблюдений (28 суток) были проведены только для кожно-мышечного лоскута. Измерения на хряще и сухожилии удалось провести в срок до 17 и 15 суток посмертного периода соответственно, т. к. далее ткани оказались непригодны для проведения измерений ввиду развития резко выраженных деструктивных изменений (рис.2).
2. На каждом конкретном сроке ДНС наблюдается дисперсия импеданса: уменьшение Z с увеличением частоты тока. Для оценки характера дисперсии импеданса Z в целом мы использовали коэффициент k_д = Z_нч/Z_вч, гдеZ_нч — импеданс на низкой частоте (100 Гц), Z_вч — импеданс на высокой частоте (100 кГц). Так, например, для кожно-мышечного лоскута в период от 0 до 15 суток ДНС значение k_д выше единицы и не превышают значение k_д = 1,8, а далее наблюдается увеличение и на сроке ДНС 27 суток k_д = 2,8.

С другой стороны, следует отметить, что при наличии дисперсии Z в целом в исследуемом интервале частот от 100 Гц до 100 кГц непосредственно для высоких частот (10 кГц и 100 кГц) дисперсия практически отсутствует, т. е. коэффициент поляризации k_п близок к единице (до 1,1) для всех сроков ДНС для всех диагностических зон в условиях естественного биоценоза.

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация/научная значимость

Следует отметить, что данные о биологических изменениях тканей в посмертном периоде, полученные в этом эксперименте, согласуются с данными, полученными ранее при изучении разложения трупов свиней в условиях естественных биоценозов севера европейской части России [18].

Ранее нами были получены данные по динамике Z [19] для трех диагностических зон аналогичных модельных биообъектов, находящихся в стандартизированных условиях (температура воздуха +4 °C, влажность 45 %) в сроки посмертного периода от 0 до 31 суток и от 61 до 80 суток. Для периода от 0 до 31 суток можно отметить, что при общей тенденции уменьшения Z его изменения представляли собой волнообразную динамику абсолютных показателей в виде начального снижения, определенного промежутка плато и дальнейшего пологого подъема, что повторялось для всех частот тока в различных диагностических зонах исследования. В период от 61 до 80 суток для кожно-мышечного лоскута наблюдалось более «спокойное поведение» Z с меньшим значением по сравнению с начальным периодом (в среднем в 4 раза). Хрящ и сухожилие в период от 61 до 80 суток оказались непригодными для проведения измерений. На рисунке 3 приведены зависимости Z от срока ДНС для хрящевой ткани в стандартизированных условиях и условиях естественного биоценоза.

Разную динамику показателей Z при нахождении трупов в стандартизированных условиях и в условиях естественного биоценоза (рис. 3) можно объяснить отличиями в протекании процессов деструкции тканей [10][20], происходящими в основном под воздействием каких-либо ферментных систем: собственных ферментов организма (аутолиз), ферментов контаминирующих труп микроорганизмов (гниение), ферментов, выделяемых личинками при заселении трупа некрофильными насекомыми, или их сочетаниями [21]. Скорость протекания всех этих процессов зависит от температуры окружающей среды: чем она выше, тем быстрее разлагается труп.

В стандартизированных условиях температура среды относительно низкая, когда микроорганизмы, контаминирующие труп, практически не активны, а энтомологический фактор отсутствует, и характер деструктивного изменения тканей медленный и определяется только протекающими в них аутолитическими изменениями. Тогда можно проследить волнообразную динамику показателей Z, по всей вероятности, определяющуюся периодами некоторой активизации и затухания процесса аутолиза тканей.

При разложении в условиях естественного биоценоза в нашем эксперименте средняя температура окружающей среды составляла +18–19 °C. При такой температуре активно происходили процессы и аутолиза, и гниения, как за счет «собственных» микроорганизмов тела, так и привнесенных из почвы, а также инкорпорирования энтомологического фактора. Это привело к быстрому развитию деструкции мягких тканей и другой динамике показателей Z: некоторого роста его абсолютных значений на протяжении четырех суток с момента наступления смерти с дальнейшим более плавным его уменьшением.

Зависимость коэффициента дисперсии k_д от срока ДНС для кожно-мышечной ткани в стандартизированных условиях и в условиях естественного биоценоза приведена на рисунке 4.

Изменение характера дисперсии с увеличением срока ДНС (рис. 4) может свидетельствовать о нарастании количества клеток с разрушенной мембраной, что связано с расщеплением ферментными системами (собственными, микроорганизмов или личинок некрофильных насекомых) фосфолипидов и белков мембран. При этом наличие схожих участков подъема k_д в более поздние сроки ДНС для стандартизированных условий (с 70-х суток ДНС) по сравнению с условиями естественного биоценоза (с 15–17-х суток ДНС) позволяет предположить наличие схожей последовательности деструктивных изменений кожно-мышечной ткани, но различной скорости их протекания, что, вероятно, связанно с более высокой температурой среды и наличием энтомологической составляющей при проведении эксперимента на улице. Можно еще отметить тот факт, что именно на 15–17 сутки эксперимента в условиях естественного биоценоза, когда отмечен подъем k_д, в целом для трупов наблюдались схожие изменения мягких тканей, которые стали осклизлыми и легко рвались при ощупывании, грудная и брюшная полости за счет возникших перфораций сообщались с внешней средой, а сухожилие и хрящ стали непригодны для исследования.

С другой стороны, следует отметить, что при наличии дисперсии Z в целом в исследуемом интервале частот (от 100 Гц до 100 кГц), непосредственно для высоких частот (10 и 100 кГц) дисперсия практически отсутствует, т. е. коэффициент поляризации k_п близок к единице для всех сроков ДНС в любых условиях. Известно, что дисперсия Z для высоких частот присуща только живым тканям и отсутствует у мертвых [22]. Именно в интервале высоких частот от 10 до 1000 кГц для живых тканей дисперсия импеданса определяется поляризацией фосфолипидов мембран клеток в поле внешнего электрического тока и дипольной поляризацией структурных образований в цитоплазме. При повреждении живой ткани и снижении ее жизнеспособности k_п уменьшается и при полной гибели приближается к единице. Такой коэффициент поляризации рассматривают собственно как характеристику жизнеспособности ткани¹.

Следует отметить, что только для кожно-мышечного лоскута в стандартизированных условиях в первые сутки ДНС коэффициент поляризации имеет медианное значение k_п = 1,41. Различия значений k_п для этой ткани в первые и четвертые сутки (k_п = 1,11) срока ДНС значимы в соответствии с критерием Вилкоксона для зависимых выборок (р = 0,01). Данный факт именно для кожно-мышечного лоскута, вероятно, можно объяснить процессами переживаемости тканей.

Таким образом, в соответствии с результатами наших исследований, наличие дисперсии Z тканей мертвого организма, так же как и отличие ее степени и характера в стандартизированных условиях и условиях естественного биоценоза, отражает особенности протекания процессов разложения тканей (аутолиза и гниения в первом случае, в сочетании с энтомологическим компонентом — во втором). А значение коэффициента поляризации близкого к единице на всем протяжении эксперимента свидетельствует о нежизнеспособности тканей.

Ограничения исследования

Ограничения исследования не установлены.

Обобщаемость/экстраполяция

Исследования направлены на установление количественного инструментария определения ДНС для использования в практике судебного эксперта. Экстраполяция данных, полученных в ходе изучения посмертных изменений тканей и динамики их импедансометрических показателей, возможна как путем классического анализа человеком-экспертом, так и с применением компьютерных методов анализа [23–25], что позволяет рекомендовать труп свиньи в качестве адекватной модели трупа человека, как для научных исследований, так и для решения конкретных научно-практических вопросов, возникающих в практике судебно-медицинской экспертизы при определении ДНС и условий постмортального периода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прослежены две стадии разложения мягких тканей трупов модельных биообъектов, которые условно можно обозначить как «преимущественно микробиологическая», а затем «микробно-зоологическая» утилизация. Существует взаимосвязь биологических изменений тканей в посмертном периоде с характером динамики их импеданса. При исследовании импеданса в условиях естественного биоценоза установлена идентичная его зависимость от срока ДНС для всех частот тока исследования всех диагностических зон модельных биообъектов: можно выделить начальный интервал 0–4 суток, где импеданс дает «всплеск» с дальнейшим более плавным его уменьшением. Для тканей мертвого организма зафиксировано наличие дисперсии импеданса в целом в исследуемом интервале частот и отсутствие дисперсии непосредственно для высоких частот. Понимание причин и сущности процессов, протекающих в теле посмертно, позволяет оценить и обосновать изменения каких-либо характеристик тканей, измеряемых количественно, в том числе и показателей импеданса, а также прогнозировать перспективность их использования в конкретных практических целях, а именно для диагностики давности наступления смерти.