Экспрессия гена стресс-индуцированного фосфопротеина 1 (STIP1) при аденомиозе: обсервационное исследование «случай — контроль»

ВВЕДЕНИЕ

Роль различных генетических и эпигенетических факторов, влияющих на изменения экспрессии отдельных генов, является предметом внимания многих исследователей при большинстве хронических заболеваний, тем более при такой мультифакториальной патологии с до сих пор не известной этиологией, как эндометриоз (и особенно внутренний генитальный эндометриоз — аденомиоз) [1–3]. Исследований по изучению экспрессии гена cтресс-индуцированного фосфопротеина 1 (stress induced phosphoprotein 1, STIP1) недостаточно, особенно с точки зрения ассоциации этого фактора с развитием различных типов аденомиоза [4][5]. Подобные исследования представляют не только теоретический, но и практический интерес.

Стресс-индуцированный фосфопротеин (STIP1, ген ID 10963; HPRD 05454) — это белок с массой 62,6 кДа, также известный как белок — организатор белков теплового шока (БТШ) (HOP, Hsp70/Hsp90-organizing protein) [6][7]. Он представляет собой ко-шаперон — полипептид, который координирует функции белков БТШ70 и БТШ90 (HSP70 и HSP90) и участвует в регуляции клеточного цикла, сплайсинга РНК, транскрипции, фолдинге белка и передаче сигналов. Роль STIP1 активно изучается при онкологических и гиперпролиферативных заболеваниях [8]. Ряд данных указывает на то, что STIP1 может стимулировать синтез ДНК и усиливать пролиферацию клеток [9]. Повышенная экспрессия STIP1 отмечается при некоторых злокачественных новообразованиях [10–14], среди гинекологической патологии он определен у пациенток с раком яичников и эндометрия, что позволило авторам предложить использование сочетанного определения маркеров CA125 и STIP1 в крови в качестве ранней диагностики этих злокачественных новообразований [15].

В настоящий момент изучением особенностей экспрессии гена STIP1 при наружном генитальном эндометриозе (НГЭ) и аденомиозе посвящено совсем мало исследований. Были представлены работы, в которых сообщалось о повышенном уровне STIP1 в сыворотке крови у женщин с НГЭ, аденомиозом и при сочетании НГЭ с аденомиозом, а также об экспрессии этого гена в эпителии и строме эктопического эндометрия [7]. В исследовании D. Chen et al. (2022) было показано присутствие белка STIP1 во внеклеточных везикулах крови и эктопического эндометрия у пациенток с аденомиозом [4]. Также были получены сведения об ассоциации аллеля G полиморфного варианта rs4980524 гена STIP1 с НГЭ, при этом отмечался более высокий уровень экспрессии STIP1 и матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9) у носителей генотипа G/G [5].

В доступной научной литературе отсутствуют результаты исследований по изучению количественных параметров уровня экспрессии гена STIP1 в тканях матки (эндометрий, миометрий) у пациенток с аденомиозом. Оценка экспрессии данного гена в пораженных тканях могла бы привести к использованию этого параметра как потенциального биомаркера аденомиоза, а возможно, и как новой терапевтической мишени для лечения заболевания.

Цель исследования — оценить экспрессию гена STIP1 в эутопическом эндометрии и миометрии у женщин с изолированным аденомиозом и при сочетании с миомой матки и наружным генитальным эндометриозом.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование выполнено по принципам наблюдательного сравнительного контролируемого исследования по типу «случай — контроль». В работу включены 55 женщин репродуктивного возраста, обратившихся за медицинской помощью в лечебное учреждение с различными жалобами, характерными для аденомиоза, миомы матки, наружного генитального эндометриоза. Также 17 женщин без гинекологических заболеваний, которые в последующем были включены в контрольную группу обратившихся для клинико-лабораторного обследования, в том числе в связи с мужским фактором бесплодия.

Условия проведения исследования

Исследование проводилось на базе клинико-диагностического отделения федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д. О. Отта» (ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д. О. Отта»). Забор материала: амбулаторный прием или стационарное исследование в зависимости от вида операции — применялась пайпель-биопсия эндометрия (амбулаторно), лечебно-диагностическая лапароскопия и/или гистероскопия (мультифокальная биопсия с забором материала для генетического и морфологического исследования эктопического и эутопического эндометрия). Биоптат, предназначенный для анализа, помещали в консервант (IntactRNA, «Евроген», Россия) и хранили до проведения анализа при температуре –20 °С. Период проведения исследования — с 01.11.2022 по 30.09.2023.

Критерии соответствия

Критерии включения

Для пациенток всех групп: возраст от 18 до 46 лет, подписанное информированное согласие об участии в исследовании;

- для пациенток основной группы: пациентки с верифицированным диагнозом «Диффузный аденомиоз» (АМ) (в том числе: изолированный АМ, с АМ при сочетании с миомой матки, с АМ при сочетании с наружным генитальным эндометриозом I и II степени (классификация Американского общества репродуктивной медицины (пересмотренная) [16]);

- для пациенток группы сравнения: пациентки с верифицированным диагнозом «Миома матки» (ММ) изолированная без аденомиоза (локализация миоматозных узлов — интрамуральная и интрамурально-субсерозная) 3–6-го типов по классификации International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) [17];

- для пациенток контрольной группы: женщины с регулярным овуляторным менструальным циклом без гинекологической патологии.

Критерии невключения

Для пациенток всех групп: возраст младше 18 и старше 46 лет, беременность, декомпенсация или наличие тяжелой хронической соматической патологии, наличие онкологических новообразований, воспалительных заболеваний органов малого таза, прием гормональных препаратов за 3 месяца до исследования, оперативные вмешательства по поводу эндометриоза и других сопутствующих заболеваний.

Для пациенток основной группы: остальные формы аденомиоза, выделенные в настоящее время [18][19], кроме диффузного, НГЭ III–IV степени [16], наличие узлов 0, 1, 2, 7-го типов по классификации FIGO, наличие миоматозных узлов 0, 1, 2, 7-го типов по классификации FIGO [17].

Для пациенток группы сравнения: наличие миоматозных узлов 0, 1, 2, 7-го типов по классификации FIGO [17].

Критерии исключения

Для пациенток всех групп: отказ от участия в исследовании; изменение диагноза в процессе проведения исследования; беременность.

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Постановка диагнозов «диффузный аденомиоз», «миома матки», «наружный генитальный эндометриоз» с последующим отбором пациенток для участия в исследовании осуществлялась на основании действующих клинических рекомендаций^1,2. Диагнозы «диффузный аденомиоз» и «миома матки» также подтверждались по результатам комплексной ультразвуковой оценки органов малого таза, магнитно-резонансной томографии (МРТ) органов малого таза, лапароскопии и гистероскопии по разработанным и запатентованным критериям ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д. О. Отта»². Диагноз «наружный генитальный эндометриоз», а также степень его распространения устанавливались интраоперационно во время проведения лечебно-диагностической лапароскопии.

Подбор участников в группы

Изначально в исследование были включены 87 пациенток: основная группа (n = 53), группа сравнения (n = 12), контрольная (n = 23). В ходе дальнейшего отбора из основной группы исключили 10 женщин — несоответствие окончательного диагноза, и 6 из контрольной группы (1 — отказ от участия в исследовании, 2 — сменили место жительства, 3 — в связи с наступлением беременности). Таким образом, всего включены в исследование 72 женщины. После окончательного формирования выборки исследования основная группа была разделена на три подгруппы: женщины с изолированным диффузным аденомиозом (АМ, n = 16), с аденомиозом при сочетании с миомой матки (АМ + ММ, n = 16), с аденомиозом при сочетании с наружным генитальным эндометриозом (АМ + НГЭ, n = 11). Кроме того, была выделена группа сравнения — женщины с миомой матки без эндометриоза (n = 12) и контрольная группа (n = 17) — относительно здоровых женщин без гинекологических заболеваний.

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

Определить уровень экспрессии мРНК гена STIP1 в миометрии, включающем железы аденомиоза и окружающий миометрий, а также в эндометрии. Показатели относительной экспрессии в работе приведены в единицах RQ (Relative Quantity). Данный параметр показывает, во сколько раз изменена экспрессия целевого гена относительно образца, для которого значение RQ равно 1. В качестве такого случайным образом с использованием программы Expression Suit был выбран образец эндометрия из группы контроля.

Дополнительные показатели исследования

Оценка морфологии гистологических препаратов: соответствие строения эндометрия дню менструального цикла, состояние желез, стромы и сосудистого компонента эндометрия, наличие/отсутствие признаков патологических изменений.

Методы измерения целевых показателей

Этапы подготовки биоматериалов для исследования экспрессии мРНК гена STIP1: гомогенизация, лизис биоматериала → выделение мРНК (набор Pure Link RNA Mini kit (Thermo Fisher Scientific, США)) → обратная транскрипция (набор High Capacity Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific, США)) → ПЦР в режиме реального времени (РВ) (Real-Time PCR System 7500 (Applied Biosystems, США)) — расходные материалы ThermoFisher — TaqMan Gene Expression Assay Hs00428979_m1 для мРНК гена STIP1). Внутренней контроль — валидированный ген MRPL19 (TaqMan Gene Expression Assay Hs00608519_m1).

Морфологическое исследование биоптатов проведено по стандартной методике: эндометрий и/или миометрий → фиксация 10 % нейтральным формалином (рН 7,2) → гистологическая проводка (гистопроцессор Histo-Tek VP1, Япония) → заливка в парафиновые блоки → изготовление срезов (стандартная толщина 3–5 мкм) → классическая окраска гематоксилин-эозином → микроскопия — световой микроскоп Olympus СХ31 (Япония) — окуляр ×10, объективы ×10, ×20, ×40.

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Искажающими факторами с возможным самостоятельным влиянием на результат исследования могли явиться сочетание пролиферативных заболеваний (миома матки, гиперплазия эндометрия, НГЭ) и предшествующие оперативные вмешательства по этому поводу (миомэктомия, цистэктомия по поводу эндометриоидных кист яичников, иссечение эндометриоидных инфильтратов при тяжелом НГЭ). Данные факторы были нивелированы на этапе формирования выборок за счет внесения их в критерии невключения.

Статистические процедуры

Принцип расчета размера выборки

Исследование наблюдательное. Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Статистический анализ полученных результатов, а именно относительный уровень экспрессии мРНК проведен методом ΔΔСt с использованием программы Expression Suit V1.0.3. (https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/technical-resources/software-downloads/expressionsuite-software.html). Показатель относительной экспрессии (RQ, relative quantity) высчитывался относительно произвольно выбранного образца эндометрия из группы контроля. Статистический анализ данных был выполнен с помощью программы GraphPad Prizm (Insight Partners, США). Во всех исследованных группах значения RQ прошли тест на нормальность (критерий Колмогорова — Смирнова). Числовые данные в таблицах представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения (M ± SD). Различия между группами оценивали с применением однофакторного ANOVA (с последующими парными post-hoc сравнениями (тест Тьюки) значений в каждой группе). Значимыми считали различия при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки (групп) исследования

Отобрано 87 женщин: основная группа (n = 53) — пациентки с верифицированным диагнозом «аденомиоз» (как с изолированным, так и в сочетании с ММ и НГЭ); группа сравнения (n = 12) — пациентки с диагнозом «миома матки» без эндометриоза; контрольная группа (n = 23) — относительно здоровые женщины без гинекологической патологии. На основании данных патогистологического исследования эндометрия из основной группы исключены: 6 пациенток с морфологией гиперплазии эндометрия без атипии, 4 — несоответствие критериям включения окончательной формы аденомиоза (очаговая и кистозная). У трех женщин контрольной группы наступила беременность, две поменяли место жительства и одна отказалась от дальнейшего участия в исследовании. Таким образом, в исследование вошли 72 женщины. Основная группа была разделена на три подгруппы: женщины с изолированным диффузным аденомиозом (АМ, n = 16), с аденомиозом при сочетании с миомой матки (АМ + ММ, n = 16), с аденомиозом при сочетании с НГЭ (АМ + НГЭ, n = 11). Блок-схема дизайна исследования представлена на рисунке 1.

Характеристики выборки (групп) исследования

Пациенты, включенные в исследование, всех групп были сопоставимы по возрасту, индексу массы тела (ИМТ). Средний возраст 35,8 ± 5,6 года, средний ИМТ 22,2 ± 2,2 кг/м². При сравнении между группами достоверно не отличались (p > 0,05). Также мы не выявили значимых различий между группами по возрасту менархе, продолжительности менструальных выделений и другим показателям, представленным в таблице 1. Из основной группы (пациентки с изолированным аденомиозом и в сочетании с миомой матки или с НГЭ) клинические проявления оцениваемой патологии наблюдались у всех исследуемых. В основном наблюдались нарушения овариально-менструального цикла: аномальные маточные кровотечения по типу обильных менструальных кровотечений (49,7 %), межменструальные кровотечения (30,0 %), болевой синдром с дисменореей (94,0 %), диспареунией (45,0 %), хроническими тазовыми болями (28,0 %). Следует отметить частое сочетание указанных жалоб при обследовании пациенток.

При проведении лапароскопии у пациенток подгруппы АМ+НГЭ (n = 11) НГЭ I степени диагностирован у 4 (36,4 %) больных, НГЭ II степени — у 7 (63,6 %). Диагноз НГЭ у всех пациенток был установлен впервые, сочетание с экстрагенитальными формами заболевания не отмечено.

Основные результаты исследования

Уровень экспрессии мРНК гена STIP1 методом ОТ-РВ-ПЦР был проанализирован в эндометрии у всех женщин, а в миометрии — у пациенток основной группы (изолированный аденомиоз, сочетание АМ и ММ) и группы сравнения.

Экспрессия мРНК гена STIP1 в миометрии

При исследовании миометрия выявлено достоверное повышение экспрессии гена STIP1 в группе пациенток с аденомиозом более чем в 3 раза (1,84 ± 0,38, p < 0,001) по сравнению с этим показателем в группе с ММ. Также экспрессия гена STIP1 была достоверно увеличена в миометрии пациенток с АМ при сочетании с ММ (1,32 ± 0,56) по сравнению с пациентками с ММ (0,51 ± 0,26, p < 0,01). Не зарегистрировано зависимости уровня экспрессии гена STIP1 в миометрии от фазы менструального цикла (табл. 2, рис. 2).

Использование в качестве группы сравнения образцов миометрия от пациенток с ММ продиктовано сложностью сбора коллекции интактного миометрия здоровых женщин. Выполнение биопсии миометрия у пациенток, не страдающих гинекологическими заболеваниями, весьма нежелательно, так как происходящее при заборе материала повреждение переходной зоны может повлечь за собой негативные последствия для пациенток в будущем и этически неприемлемо. Кроме того, для получения достоверной информации, необходимо выполнение именно полифокальной биопсии миометрия (в области дна, трубных углов, по передней, задней стенкам матки и перешейка, всего в среднем 6 биоптатов), меньшее количество гистологических образцов является менее информативным и недостаточным для подтверждения диагноза [17]. Выполнение биопсии миометрия у пациенток с аденомиозом также связано с повреждением переходной зоны, которое может быть причиной дальнейшего прогрессирования патологического процесса. Биопсия миометрия с исследовательской целью может нанести ущерб здоровью пациенток и не может широко рекомендоваться к использованию. По указанным причинам следует отметить низкую частоту выполнения полифокальной биопсии миометрия в клинической практике.

Экспрессия гена STIP1 в эндометрии

Результаты данного исследования показали снижение (в среднем в 1,4 ± 0,1 раза) экспрессии мРНК гена STIP1 в эндометрии у женщин с установленным диагнозом «аденомиоз» по сравнению с пациентками с миомой матки без эндометриоза, а также с подгруппой АМ + НГЭ. При этом не было отмечено значимых различий в уровне экспрессии гена STIP1 при сравнении между всеми группами пациенток с АМ и контролем (табл. 3, рис. 3). Экспрессия гена STIP1 в эндометрии также существенно отличалась в зависимости от фазы менструального цикла.

Дополнительные результаты исследования

Результаты оценки морфологии эндометрия: у большинства женщин было выявлено соответствие гистологической картины фазам менструального цикла, соответствующим времени забора материала: 39 (54,2 %) женщин — пролиферативная фаза (с 5 по 14 день), 33 (45,8 %) — секреторная (с 16 по 26 день МЦ). При сравнении показателей отдельных групп анализ биоптатов эндометрия проводился в соответствующие фазы МЦ с практически равным распределением по количеству женщин в группах, р > 0,05 (табл. 4).

При оценке морфологии миометрия отмечается характерное строение очагов аденомиоза с сочетанием железистого эндометриоподобного эпителия и цитогенной стромы. Соотношение стромы и железистых элементов в очагах аденомиоза может быть различным. В зависимости от степени распространения аденомиоза в миометрии обнаруживаются единичные или множественные эндометриоидные гетеротопии. В данном исследовании имелись трудности при выполнении мультифокальной биопсии миометрия, в том числе по причине невозможности получения большого объема материала, что часто не позволяет по количеству и размерам эндометриоидных гетеротопий в миометрии говорить о распространении процесса.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

В результате проведенного исследования выявлено статистически значимое (по сравнению с показателем в группе с миомой матки) повышение уровня экспрессии гена STIP1 в миометрии пациенток с изолированным аденомиозом. Кроме этого, выявлено значимое увеличение экспрессии данного гена в миометрии пациенток с аденомиозом при сочетании с миомой матки по сравнению с пациентками только с миомой матки без эндометриоза. Эти данные подтверждают роль продуцируемого в миометрии белка STIP1 в патогенезе исследуемой патологии. В уровне экспрессии гена STIP1 в эндометрии при сравнении всех подгрупп пациенток основной и контрольной группы не выявлено статистически значимых отличий, поэтому в практической деятельности в качестве диагностического маркера развития аденомиоза и прогноза агрессивности течения заболевания данный показатель использовать нецелесообразно.

Ограничения исследования

Сравнительная доступность эндометрия сделала возможным проведение данного исследования во всех группах обследуемых женщин, в том числе и в контрольной, в то же время мы столкнулись с трудностями получения образцов миометрия у женщин контрольной группы, что было обсуждено ранее. Сложности с набором конт­рольной группы для оценки изменений миометрия при самых разных видах гинекологической патологии встречаются и у других исследователей. Так, в работе S. Qi et al. [20] в качестве контрольной группы объектом для исследований был эндометрий, а не миометрий. В другом исследовании [21] было сравнение миометрия при аденомиозе с миометрием группы сравнения, в которой проводилась плановая гистерэктомия. Показаниями к операции у этой группы явились: пролапс тазовых органов, аномальное маточное кровотечение (без указания истинных причин), доброкачественные опухоли яичников, цервикальная интраэпителиальная неоплазия. Безусловно, такая разнородная группа не может рассматриваться как адекватный контроль. По причине сложности набора групп сравнения исследователи часто включают в них пациенток с различными видами гинекологической патологии только на основании отсутствия у них аденомиоза. Возможно, в качестве контрольной группы можно использовать миометрий пациенток, у которых подозревался аденомиоз методами неинвазивной оценки, например по данным УЗИ, но при выполнении мультифокальной биопсии миометрия дианоз не подтвердился. Однако отсутствие эндометриоидных очагов в биоптате миометрия может быть связано с погрешностями при взятии материала, техникой проведения трепан-биопсии и не исключает их наличия в окружающем миометрии. С нашей точки зрения, группу сравнения могут составить пациентки без аденомиоза, но с другой гинекологической патологией. В данном исследовании такая группа сравнения была сформирована — это пациентки с миомой матки.

К ограничениям следует отнести и небольшие выборки оценки эндометрия и миометрия в зависимости от фазы менструального цикла. Возможно, взятие материала в определенные дни менструального цикла у всех пациентов унифицировало полученные данные и привело к увеличению выборок.

Интерпретация результатов исследования

Изучению роли STIP1 посвящено большое количество исследований в области биологии гиперпролиферативных и онкологических заболеваний [8]. Исследователи в основном изучают белок, продукт гена STIP1. Ряд данных указывает на то, что STIP1 может стимулировать синтез ДНК и усиливать пролиферацию клеток [9]. Уровень экспрессии STIP1 и его количество в сыворотке крови прямо коррелируют с опухолевой прогрессией, метастазированием, негативным прогнозом и рецидивированием при различных видах рака [11][12][22]. В то же время исследования, посвященные изучению STIP1 в патогенезе гиперпролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы, в том числе аденомиоза, немногочисленны.

В доступных научных литературных источниках нет информации об исследованиях, посвященных количественной оценке экспрессии мРНК гена STIP1 в эндометрии или миометрии у пациенток с аденомиозом, что и определяет актуальность нашей работы, внося вклад в расширение представлений о патогенетических особенностях этой патологии, что может представлять не только теоретический, но и практический интерес для клиницистов в плане диагностики заболевания и даже распространенности и степени тяжести процесса.

Наше исследование показало диагностически значимое (более чем в 3 раза по сравнению с группой с пациенток миомой матки без эндометриоза) повышение экспрессии мРНК гена STIP1 в миометрии пациенток с изолированным аденомиозом. Также отмечался рост экспрессии данного показателя в миометрии женщин с АМ при сочетании с миомой матки (по сравнению с пациентками с миомой матки без эндометриоза) (p < 0,01). Вышеперечисленные результаты подтверждают роль белка STIP1 в патогенезе группы заболеваний, связанных в эндометриальной гетеротопией. Также выявленный статистически значимый рост экспрессии гена STIP1 в миометрии у пациенток с АМ и АМ + НГЭ может свидетельствовать о высокой пролиферативной активности, характерной для тканей с диффузным аденомиозом. По данным литературы [7], при аденомиозе белок STIP1 при иммуногистохимическом исследовании определяется в эпителиальных и стромальных клетках эктопического эндометрия. Полученные данные настоящего исследования также показали пониженную при аденомиозе экспрессию гена STIP1 (RQ 0,78 ± 0,46) в эутопическом эндометрии, при этом в миометрии без эндометриоза (группа сравнения) этот показатель был еще ниже (RQ 0,51 ± 0,50). В связи с этим можно предположить, что у больных аденомиозом гиперэкспрессия данного гена в миометрии (а также АМ + ММ и АМ + НГЭ) обеспечивается присутствием эктопического эндометрия и является характерной особенностью этой патологии. Эти результаты согласуются с данными других исследований, которые были получены при иммуногистохимической оценке белка STIP1 в эктопическом эндометрии [7][12].

Несмотря на ожидания, что оценка экспрессии гена STIP1 в эндометрии у пациенток с аденомиозом может быть использована в качестве прогностического маркера развития и прогрессирования этой патологии, данные предположения в настоящий момент не нашли подтверждения: отсутствовали значимые отличия в уровне экспрессии гена STIP1 в эндометрии при сравнении всех подгрупп пациенток с аденомиозом и контрольной группой. При этом особый интерес представляет обнаружение статистически значимых различий в экспрессии гена STIP1 в эндометрии между двумя подгруппами пациенток с изолированным аденомиозом и с аденомиозом при сочетании с НГЭ. В настоящее время принято считать, что эти формы заболевания различаются по локализации патологического процесса (так называемый «внутренний» и «наружный» аденомиоз), факторам риска (например, наличию внутриматочных вмешательств) и ряду других характеристик [19]. Весьма вероятно, что нам удалось выявить снижение экспрессии STIP1 как характерную особенность эутопического эндометрия при классическом диффузном аденомиозе («внутреннем» аденомиозе), однако это предположение нуждается в дополнительных доказательствах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное сравнительное наблюдательное исследование показало повышенную экспрессию мРНК гена STIP1 в миометрии пациенток с аденомиозом, что подтверждает роль этого белка в патогенезе данного заболевания. Гиперэкспрессия белка STIP1 в миометрии пациенток с аденомиозом, по-видимому, обусловлена присутствием очагов эктопического эндометрия с высокой пролиферативной активностью. Дальнейшее изучение экспрессии гена STIP1 при обследовании большего числа однородных групп позволит получить дополнительные результаты и определить новые подходы к лечению заболевания.