Анализ содержания белковых маркеров в плазме крови больных с синдромом зависимости от наркотических веществ: наблюдательное клиническое исследование

ВВЕДЕНИЕ

Актуальной проблемой современной психиатрии и наркологии является объективизация диагностического процесса. В наркологической практике диагностический процесс прежде всего основывается на химико-токсикологическом определении субстрата интоксикации, относящегося к группе наркотических веществ, или его метаболита [1][2]. Тем не менее остаются нерешенными вопросы, связанные с лабораторным мониторингом и прогнозированием, которые могли бы сформировать основу вторичной профилактики. В качестве перспективных лабораторных маркеров наркопатологии рассматривают различные молекулы, образующиеся в организме больных в ответ на введение наркотической субстанции. Такими молекулами могут быть некоторые специфические белки нервной ткани, субстраты эндотоксикоза, нейромедиаторы и ферменты их обмена, рецепторы нейромедиаторов и антитела к ним, про- и противовоспалительные факторы, такие как цитокины, компоненты антиоксидантной системы и маркеры окислительного стресса [3–6]. Наиболее интересными ввиду более высокой специфичности являются белковые маркеры. В литературе представлен достаточно противоречивый анализ изменений содержания белков, тем не менее одними из наиболее перспективных являются такие белки, как мозговой нейротрофический фактор (BDNF, brain-derived neurotrophic factor) и нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor), участвующие в регуляции роста и дифференцировки различных типов нейронов [7][8]. К нейротрофическим факторам также относят белок S100B, галанин и др. Некоторые авторы рассматривают в качестве перспективных маркеров альфа-синуклеин, который значительно увеличен в сыворотке крови больных алкоголизмом, инсулиноподобный фактор роста-1, пролактин и др. [9–11]. Тем не менее литературные данные об изменениях уровня белков в крови больных с синдромом зависимости от опиоидов или психостимуляторов имеют отрывочный и противоречивый характер, что актуализирует необходимость систематизации данных и проведения комплексного сравнительного определения изменений отдельных белков [12–14].

Нейротрофические факторы (нейротрофины) представляют собой обширное семейство секретируемых белков, которые обеспечивают процессы регуляции выживаемости, пролиферации и дифференцировки клеток нервной ткани, а также имеют ведущее значение в регуляции пластичности в центральной нервной системе. Особое внимание заслуживают белки, связанные с нейромедиаторными системами, нарушения метаболизма которых во многом составляют основу формирования химических аддикций. К таким факторам прежде всего относят BDNF и GDNF, связанные преимущественно с серотонинергической (BDNF) и дофаминергической (GDNF) системами мозга [15], хотя такое деление достаточно условно. Так, известно, что в норме BDNF также имеет связь с другими нейромедиаторными системами, в частности с дофаминергической. Это подтверждается тем, что почти половина дофаминергических нейронов, экспрессирующих тирозингидроксилазу, одновременно экспрессируют BDNF [16]. С другой стороны, данный нейротрофин наиболее распространен в головном мозге, поэтому нет ничего удивительного, что он широко представлен в разных типах нейронов. Экспрессия BDNF изменяется в широких пределах в ответ на действие различных стрессорных факторов, травму, гипогликемию, ишемию, повреждения головного мозга разного этиопатогенеза [17][18].

Нарушения, связанные с экспрессией и метаболизмом BDNF, могут быть связаны с развитием химических аддикций [19–22]. Так, у больных алкоголизмом определяется изменение содержания BDNF в сыворотке крови, которое в определенной мере соответствует клинической картине заболевания — более низкий уровень наблюдается при интоксикации, однако на фоне абстинентного синдрома уровень BDNF возрастает [15][23–25]. GDNF был выделен из культуры клеток глиомы и в настоящее время получил признание как фактор, необходимый для развития, поддержания и защиты нигростриатных дофаминергических нейронов.

Формирование наркотической зависимости, абстинентного синдрома и толерантности связано с нарушением функционирования различных физиологических и биохимических систем, в особенности с изменением активности нейромедиаторных систем. Три основные системы участвуют в формировании систем подкрепления: дофаминергическая, опиоидергическая, ГАМК-ергическая [26]. Каждая группа наркотических веществ характеризуется определенными особенностями, но для всех психоактивных веществ общей молекулярной мишенью фармакологического действия является система дофаминовой нейромедиации. Одним из основных компонентов формирования пристрастия является активация церебральной системы вознаграждения, центральным звеном которой являются дофаминергические нейроны А10 вентральной области покрышки [27].

Цель исследования — определение изменений содержания в плазме крови некоторых потенциальных биомаркеров наркопатологии белковой химической природы.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Работа выполнена по дизайну наблюдательного клинического исследования. В исследование включен 31 больной с диагнозом «синдром зависимости от психоактивных веществ» и 15 здоровых испытуемых лиц, наблюдавшихся в рамках профмедосмотров.

Условия проведения

Больные наблюдались на базе государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Наркологический диспансер» Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ НД), относительно здоровые испытуемые лица наблюдались на базе Клиники федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО Кубгму Минздрава России). Лабораторный этап исследования выполнен на базе клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ НД и лаборатории кафедры фундаментальной и клинической биохимии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. Период проведения исследования: с июля 2021 по июль 2022 года.

Критерии соответствия

Критерии включения

Критерии включения в исследование для группы контроля: возраст 20–35 лет; мужской пол, отсутствие соматических патологий, состояние психического здоровья на момент обследования, наличие добровольного информируемого согласия.

Критерии включения в исследование для основных групп: возраст 20–35 лет; мужской пол; верифицированный диагноз: «синдром зависимости от опиоидов» или «синдром зависимости от психостимуляторов», наличие добровольного информируемого согласия в письменном виде.

Критерии невключения

Возраст старше 35 или моложе 20 лет; женский пол; наличие онкологических заболеваний; наличие острых или хронических болезней в фазе обострения, не относящихся к исследуемым нозологическим формам (например, декомпенсированная патология сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, почек, ВИЧ-инфекция и прочее); неврологические и психические расстройства; неконтролируемый прием лекарственных препаратов, прием биологически активных добавок, лекарственных трав, отягощенный аллергологический анамнез, отказ от включения в исследование.

Критерии исключения

Отказ от дальнейшего наблюдения, отказ от прохождения реабилитационно-противорецидивного этапа лечения, рецидив заболевания (определение психоактивных веществ в биологических жидкостях в процессе реабилитации).

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Отбор испытуемых лиц включал установление диагноза «синдром зависимости от психоактивных веществ» (опиоиды или психостимуляторы) на основании клинической диагностики в соответствии с клиническими рекомендациями [1]. Факт употребления наркотиков был подтвержден химико-токсикологическим определением наркотического вещества или его метаболита в крови и/или моче.

Подбор участников в группы

Выборка участников исследования формировалась сплошным методом. В основную группу (2-я группа) был включен 31 больной, но до конца наблюдения были доведены 18 больных с диагнозами «синдром зависимости от опиоидов» (n = 11) или «синдром зависимости от психостимуляторов» (n = 7). Параллельно была набрана контрольная группа (1-я группа, n = 15) здоровых испытуемых лиц, которые наблюдались в рамках профмедосмотров.

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

В плазме крови определяли содержание 5 белков: мозгового (BDNF) и глиального (GDNF) нейротрофических факторов, нейронспецифической энолазы (NSE), альфа-синуклеина и кальций-связывающего белка S100B, которые исходя из анализа литературных данных нам представлялись наиболее перспективными маркерами для лабораторной оценки состояния больных с синдромом наркотической зависимости.

Дополнительные показатели исследования

Не предусмотрены.

Методы измерения целевых показателей

У лиц контрольной группы осуществляли однократный забор крови для проведения биохимических исследований на содержание белковых маркеров. Наблюдение за больными 2-й группы было разделено на 2 традиционных этапа: этап дезинтоксикационно-стабилизационного курса терапии (18–20 дней) и реабилитационно-противорецидивный этап (4–6 месяцев). В начале каждого этапа и по его окончанию выполняли забор крови для лабораторных исследований. Таким образом, исследования содержания белковых маркеров в плазме крови больных выполняли 4 раза (рис. 1). Проведение дезинтоксикационно-стабилизационного курса терапии основывалось на коррекции психических расстройств, инфузионной детоксикационной терапии, применении гепатопротекторов и витаминотерапии. Реабилитация проводилась в 3 традиционных этапа: адаптационный, интеграционный и стабилизационный. Все больные, отобранные для проведения исследования, имели исходный средний реабилитационный потенциал. Проведение реабилитационного курса включало психотерапевтические и физиотерапевтические мероприятия, а также медикаментозную коррекцию. В зависимости от этапа и текущего состояния больные получали лекарственные средства из группы нейролептиков, антидепрессантов, блокаторов опиатных рецепторов, гепатопротекторов, ноотропов и витаминов.

В плазме крови определяли содержание 5 белков: мозгового (BDNF) и глиального (GDNF) нейротрофических факторов, нейронспецифической энолазы (NSE), альфа-синуклеина и кальций-связывающего белка S100B, которые исходя из анализа литературных данных нам представлялись наиболее перспективными маркерами для лабораторной оценки состояния больных с синдромом наркотической зависимости. Определение концентрации белков в биологической жидкости было основано на иммуноферментном методе, реализованном в наборах реагентов Cloud-Clone Corp. (США). Выполнение лабораторного этапа исследования осуществляли на базе кафедры фундаментальной и клинической биохимии ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России с использованием мультимодального планшетного ридера Fluostar Omega (BMG, Германия), вспомогательного лабораторного оборудования и программного обеспечения.

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Искажающими факторами, способными самостоятельно влиять на уровень определяемых белковых маркеров в сыворотке или плазме крови, прежде всего являются заболевания психиатрического профиля, органические поражения центральной нервной системы. Данные факторы были нивелированы на этапе формирования выборок за счет внесения их в состав критериев невключения. Также косвенным свидетельством отсутствия заметного влияния органических поражений центральной нервной системы может быть низкий уровень классических периферических маркеров поражения нервной ткани — белков S100 и NSE.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Статистический анализ данных был основан на расчете непараметрических критериев Манна — Уитни для сравнения показателей контрольной и опытной групп и критерия Вилкоксона для сравнения показателей одной группы, полученных на разных этапах наблюдения. Выбор критериев был обоснован сравнительно небольшим объемом выборок и отличием распределения показателей от нормального закона. В качестве уровня статистически значимой степени различий между группами была принята вероятность ошибки гипотезы не более 5%. Проведение расчетов осуществляли с помощью программ StatPlus версия 7 (AnalystSoft Inc., США). В иллюстративном материале статьи данные представлены в виде медианного значения показателей, 1-го и 3-го квартилей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки исследования

Для проведения исследования были сформированы две группы (рис. 1). В основную группу (2-я группа) был включен 31 больной, но до конца наблюдения были доведены 18 больных с диагнозами «синдром зависимости от опиоидов» (n = 11) или «синдром зависимости от психостимуляторов» (n = 7). Больные выбывали из исследования по причине отказа от участия или отказа от прохождения реабилитационного курса, а также по причине рецидива заболевания, подтвержденного обнаружением психоактивных веществ в биологических жидкостях. Параллельно была набрана контрольная группа (1-я группа, n = 15) здоровых испытуемых лиц, которые наблюдались в рамках профмедосмотров (рис. 1).

Характеристики выборки (групп) исследования

Испытуемые лица, включенные в контрольную и опытную группы, были сопоставимы по полу (все мужчины) и возрасту. Возраст мужчин 1-й группы составлял 29 (25–32) лет, 2-й группы — 29 (26–32) лет.

Основные результаты исследования

Проведенные исследования позволили выявить статистически значимые изменения трех белковых маркеров из пяти изученных на разных этапах наблюдения больных с синдромом зависимости от психостимуляторов и опиоидов относительно контрольных показателей, полученных при исследовании относительно здоровых добровольцев. Определение уровня мозгового нейротрофического фактора в плазме крови на этапе поступления больных 2-й группы в стационар показало сниженное значение данного показателя на 45% (рис. 2). Проведение курсов дезинтоксикационной и психофармакологической терапии способствовало поддержанию в крови более высокого уровня анализируемого нейротрофического фактора, соответствующего контрольным значениям показателя. Однако к окончанию реабилитационного курса наблюдалось снижение уровня данного показателя в 3,9 раза ниже контрольного показателя.

Определение содержания нейротрофического фактора глиальной клеточной линии показало противоположные описанным выше результатам для BDNF. Так, уже на этапе поступления в стационар в фазе обострения синдрома зависимости от опиоидов или психостимуляторов содержание GDNF в плазме крови превышало контрольные значения соответствующего параметра в 1,9 раза (рис. 3). Проведение курса лечения и реабилитации способствовало постепенному снижению уровня анализируемого белкового маркера до контрольных цифр уже к началу реабилитации с сохранением данной тенденции на протяжении всего периода наблюдений.

Определение содержания нейронспецифической энолазы в плазме крови больных 2-й группы продемонстрировало низкий уровень данного показателя, сниженный на 36% относительно контроля, а также отсутствие ответа на проведение дезинтоксикационно-стабилизационного курса лечения (рис. 4). Тем не менее к концу проведения реабилитационных мероприятий содержание нейронспецифической энолазы увеличивалось до уровня контрольных значений аналогичного параметра.

Определение в плазме крови больных 2-й группы содержания альфа-синуклеина и кальций-связывающего белка S100B не выявило каких-либо статистически значимых различий от значений соответствующих параметров контрольной группы (14,0 (13,9–14,8) нг/мл S100B; 4,6 (4,3–4,9) нг/мл альфа-синуклеина). При этом не было выявлено каких-либо изменений ни в фазе обострения синдрома зависимости от наркотических веществ, ни в процессе проведения лечебных и реабилитационных мероприятий. Отсутствие резко увеличенного содержания в плазме крови белков S100B и NSE свидетельствует о низкой вероятности или выраженности цитолитического синдрома, характеризующегося разрушением клеток ЦНС.

Дополнительные результаты исследования

Дополнительные результаты в ходе исследования не получены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Определение уровня BDNF и NSE в плазме крови на этапе поступления больных 2-й группы в стационар показало сниженное значение данного показателя на 45 и 36% соответственно, а после реабилитационного курса наблюдалось сниженное значение уровня BDNF в 3,9 раза, но увеличение уровня энолазы до контрольных значений. Содержание GDNF в плазме крови на этапе поступления в стационар превышало контрольные значения соответствующего параметра в 1,9 раза, однако в дальнейшем данный параметр быстро возвращался к нормальным значениям.

Ограничения исследования

Результаты настоящего исследования были получены на небольших выборках пациентов. Для дальнейшего развития выполненной работы необходимо проведение исследования с бóльшим объемом выборки, большей продолжительностью и возможным разделением основной группы на подгруппы в зависимости от типа употребляемого психоактивного вещества.

Интерпретация результатов исследования

Разнонаправленный характер изменений уровня нейротрофических факторов в плазме крови может свидетельствовать о специфическом влиянии наркотических веществ на метаболизм клеток нервной ткани. Более низкий уровень мозгового нейротрофического фактора и нейронспецифической энолазы может косвенно указывать на наличие дистрофических процессов, а также уменьшение общего количества и активности нейронов в ЦНС [28]. Уровень экспрессии и синтеза мозгового нейротрофического фактора связан с процессами нейрогенеза и нейропластичности [14]. В пользу предположения о снижении общего количества клеток также свидетельствует сохранение низкого содержания BDNF даже после полноценного реабилитационного периода, длительность которого составляла более 6 месяцев. Снижение содержания мозгового, на фоне увеличенного уровня глиального нейротрофического фактора можно также рассматривать как функциональные изменения, связанные с особенностями влияния наркотиков на нейромедиаторный обмен.

Считается, что BDNF связан с серотонинергической нейромедиаторной системой, тогда как GDNF считается преимущественно дофаминергическим [13]. Эти две нейромедиаторные системы находятся в антагонистических отношениях, что может характеризоваться разнонаправленными изменениями связанных с ними нейротрофических факторов. Нарушения медиаторного обмена, в частности усиление синтеза и секреции дофамина, снижение скорости его инактивации на ранних стадиях или адаптивное снижение образования катехоламинов, снижение количества их рецепторов в более поздние сроки, являются ведущими патобиохимическими механизмами формирования синдрома зависимости от наркотических веществ [27]. Активация системы вознаграждения сопровождается увеличением синтеза дофамина, снижение выброса дофамина характерно для развития абстинентного синдрома. Так, действие психоактивных веществ приводит к секреции дополнительных порций дофамина из крупных пузырьков синапса, некоторые наркотические вещества непосредственно стимулируют постсинаптические дофаминовые рецепторы. Это действие может сопровождаться положительно окрашенными эмоциональными переживаниями и развитием галлюцинаций. Свободный дофамин быстро инактивируется по одному из механизмов, включая работу моноаминооксидазы, или возвращается в депо. На фоне увеличения выброса дофамина развивается компенсаторное снижение чувствительности рецепторного аппарата.

Регулярное поступление наркотиков в организм человека приводит истощению запасов нейромедиатора, что на фоне стимуляции «нормальной» интенсивности сопровождается недостаточной реакцией системы подкрепления. Это сопровождается ухудшением настроения, ощущением слабости, утомляемости, эмоциональным дискомфортом, депрессивными расстройствами. Возникает желание приема очередной дозы наркотического вещества для купирования вышеописанных расстройств. Действительно, введение в этих условиях наркотика стимулирует выброс дофамина из депо, что временно нивелирует его относительный дефицит в синаптической щели и нормализует деятельность лимбических структур мозга. Формируется «порочный круг», который лежит в основе развития психической зависимости от психоактивных веществ. Определение уровня дофамина в сыворотке крови может дать ценную диагностическую информацию [16]. Увеличенные значения концентрации дофамина характерны для абстинентного синдрома, а также для начального периода ремиссии. Прогрессирование ремиссии, однако, характеризуется снижением уровня дофамина в крови. Поддержание в головном мозге низкой концентрации дофамина может быть основой сохранения патологического влечения к наркотикам и формирования в последующем рецидивов заболевания [27].

Полученные в исследовании данные изменения уровня мозгового нейротрофического фактора, особенно в конце реабилитационного периода, в целом согласуются с описанными в литературе изменениями уровня дофамина в периоде ремиссии. Это также косвенно подтверждает предположения о причинах разнонаправленных изменений белков BDNF и GDNF. Однако в лабораторной диагностике предпочтительнее может оказаться определение более стабильных белковых маркеров, чем быстро инактивируемых биогенных аминов. Также полученные данные подтверждают, что даже после полноценного реабилитационного курса сохраняется высокий риск формирования рецидивов, обусловленный относительно низкой активностью дофаминергической системы, что было опосредовано низким уровнем BDNF.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, были получены данные, свидетельствующие о наличии изменений некоторых белковых маркеров (BDNF, GDNF, NSE) в плазме крови больных с синдромом зависимости от опиоидов или психостимуляторов как в фазе обострения, так и в процессе лечения и реабилитации. Реабилитационный период характеризовался сравнительно быстрой нормализацией уровня GDNF и NSE, однако уровень BDNF, несмотря на успешное проведение всего терапевтического курса, в течение минимум 6 месяцев оставался сниженным, что может указывать на наличие изменений необратимого характера в ЦНС больных, злоупотребляющих веществами, относящимися к группе наркотиков. Кроме того, учитывая известную связь BDNF с дофаминергической нейромедиаторной системой, низкий уровень анализируемого белка может свидетельствовать о сохранении дефицита дофамина даже по окончании реабилитационного периода и существовании высокого риска рецидивов заболевания. Определение данных белковых маркеров может потенциально использоваться для лабораторного мониторинга эффективности терапевтических и реабилитационных мероприятий наркопатологии.