Герминальные мутации у пациентов при лейкоплакии и раке слизистой оболочки ротовой полости: проспективное наблюдательное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Стандартным методом молекулярно-генетической диагностики новообразований считается полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая обладает рядом преимуществ, в частности высокими показателями диагностической чувствительности и специфичности и относительно невысокой стоимостью одного исследования. Тем не менее ПЦР-диагностика позволяет выявить только известные мутации в ограниченном наборе генов, что ограничивает диагностические и прогностические возможности данного метода [1].

Указанных недостатков лишен метод высокопроизводительного секвенирования (NGS — new generation sequencing), который позволяет выявить первичную генетическую последовательность любых генов, интересующих исследователя. Существенным недостатком метода является высокая стоимость одного запуска секвенатора, но указанный недостаток преодолевается путем использования так называемого таргетного секвенирования, т. е. секвенирования заранее выбранного набора генов. Такой вид секвенирования обходится существенно дешевле, чем секвенирование всего генома или его значительной части, и по стоимости выявления одной генетической аномалии может быть дешевле ПЦР-исследования [2][3].

Согласно данным мировой статистики, на сегодняшний день онкологические заболевания занимают второе место в структуре причин смертности в развитых странах и третье место — в общей структуре смертности развивающихся стран. Рак слизистой оболочки ротовой полости (СОРП) и губ составляет 3% от всех случаев рака. Известно, что 11% всех заболеваний СОРП имеют высокий риск злокачественной трансформации [4]. На начальных этапах своего развития процесс обратим, а своевременное и рациональное лечение заболеваний СОРП при дисплазии эпителия предупреждает развитие злокачественных опухолей СОРП¹ [5]. При этом пятилетняя выживаемость пациентов со злокачественными новообразованиями СОРП составляет не более 50% [6].

Количество исследований, посвященных молекулярной генетике лейкоплакий и плоскоклеточного рака СОРП, невелико, а результаты их, как правило, носят предварительный характер. Так, показано, что плоскоклеточный рак СОРП (ПРСОРП) может быть ассоциирован с мутациями в генах семейства NOTCH [7], Mcm2 (с сопутствующей повышенной экспрессией данного гена) [8], TP53 (описана патогенная мутация данного гена TP53Arg72Pro) [9], в генах FBXL5, UGT2B15, UGT2B28, KANSL1, GSTT1 и DUSP22 [10], в семействе генов RAS (Ha-ras, Ki-ras и N-ras) [11], в генах FAT1 и COL9A1 (генетические варианты rs28647489 и rs550675 соответственно) [12] и др.

В Республике Беларусь исследований подобного рода ранее не предпринималось. Можно предполагать, что существуют региональные особенности патогенных генетических вариантов, ассоциированных с развитием лейкоплакий СОРП (ЛСОРП) и плоскоклеточного рака СОР. Знание подобных вариантов позволило бы разработать ПЦР- и NGS-тест-системы для выявления клинически значимых мутаций, что, в свою очередь, позволило бы расширить и дополнить существующие протоколы по оказанию помощи пациентам с заболеваниями СОРП, прежде всего в аспекте ранней диагностики диспластических процессов в эпителии СОРП и прогнозирования особенностей их течения и исхода. Анализ индивидуального профиля патогенных мутаций, ассоциированных с диспластическими и неопластическими процессами, в теории дает возможность персонализировать схемы терапии пациентов, позволяя добиваться максимальной эффективности лечения.

Цель исследования — используя метод высокопроизводительного секвенирования, идентифицировать патогенные герминальные генетические варианты у пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки ротовой полости и дисплазией эпителия 1-й степени, а также с плоскоклеточным раком слизистой оболочки ротовой полости.

МАТЕРИАЛЫ

Дизайн исследования

Проспективное, основанное на наблюдении, поперечное (cross-sectional), без контрольной группы, 48 образцов крови пациентов с онкологическими заболеваниями слизистой оболочки полости рта.

Условия проведения исследования

Исследование проводилось на базе Центра коллективного пользования «Геном» Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси с привлечением высококвалифицированных специалистов из лаборатории молекулярной генетики, лаборатории генетики человека и группы биоинформатики данного государственного научного учреждения.

Критерии соответствия

Критерии включения

Пациенты любого пола 18 лет и старше с морфологически верифицированным диагнозом ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени либо с морфологически верифицированным диагнозом ПРСОРП, подписавшие информированное согласие об участии в исследовании.

Критерии невключения

Пациенты моложе 18 лет, беременные женщины, пациенты с тяжелым течением либо декомпенсацией сопутствующих соматических заболеваний, а также пациенты, отказавшиеся подписать информированное согласие об участии в исследовании.

Критерии исключения

Изменение диагноза, выявление беременности либо развитие декомпенсации одного или нескольких сопутствующих соматических заболеваний у пациентов из сформированной выборки, произошедшие в ходе исследования.

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Диагностические критерии для пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки ротовой полости с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени: основной морфологический элемент — бляшка серовато-белого цвета, с четкими краями, перламутровым блеском на видимо не измененной СОРП, которая представляет собой неравномерное помутнение эпителия; не выступает над уровнем окружающих участков СОРП; не снимается при поскабливании; слизистая оболочка на участках поражения берется в складку; гистологически — явления гиперкератоза, слабо выраженного акантоза, атипическая трансформация плоскоклеточного эпителия, затрагивающая не более трети его толщины; при люминесцентном исследовании — голубое свечение участка поражения; при оптической когерентной томографии (ОКТ-исследовании) изображение слоистое, дифференцируются два горизонтально ориентированных слоя.

Диагностические критерии для пациентов плоскоклеточным раком слизистой оболочки ротовой полости: наличие опухолевого образования или длительно незаживающей язвы (возможно — с некротическим налетом) в полости рта; длительное, вялое течение процесса, не поддающееся консервативному лечению; безуспешность консервативного лечения; увеличение размеров патологического очага, несмотря на проведенное адекватное лечение; появление уплотнения вокруг или в основании патологического очага; кровоточивость, неприятный запах изо рта; появление плотных увеличенных безболезненных регионарных лимфатических узлов; гистологически — малигнизированные эпителиальные клетки, которые могут располагаться в виде пучков, тяжей или неправильной формы гнезд. Клетки имеют сходство с многослойным эпителием. Опухоль разрушает базальную мембрану и прорастает в подлежащую соединительную ткань.

Подбор участников в группы

В ходе исследования было отобрано 24 образца крови пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки ротовой полости (ЛСОРП) и 24 образца крови пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки ротовой полости (ПРСОРП).

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

Количество найденных патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов, ассоциированных с развитием ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени и ПРСОРП.

Дополнительные показатели исследования

Настоящим исследованием не предусмотрены.

Методы измерения целевых показателей

Лабораторные методы исследования

Периферическая кровь забиралась из кубитальной вены утром натощак в вакуумные пробирки объемом 10 мл с К2 ЭДТА (Дикал этилендиаминтетрауксусной кислоты), после чего из нее путем центрифугирования получали плазму, которую подвергали глубокой заморозке для последующего хранения (t° = –80 °C).

Для выделения ДНК использовали диагностический набор QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Германия). Все операции по подготовке ДНК-библиотек к секвенированию выполняются пошагово в строгом соответствии с инструкциями по применению, прилагаемыми производителем (Illumina, Inc., США) к набору реагентов для экзомного секвенирования Illumina Nextera DNA Exome (Illumina, Inc., США)^{2 3} [13][14].

Набор Nextera DNA Exome предназначен для секвенирования т. н. экзома — части генома человека, включающего экзоны, то есть последовательности, которые непосредственно транслируются в белки. Экзом человека содержит приблизительно 180 тысяч экзонов, что соответствует примерно 1% всего генома, или 30 миллионам пар нуклеотидов [15]. Тем не менее мутации в экзоме составляют до 85% от всех мутаций, связанных с различными заболеваниями — как врожденными, так и приобретенными [16]. Набор требует ≈40 нг ДНК для пробоподготовки, обеспечивая при этом аналитическую чувствительность >96% и аналитическую специфичность на уровне 99,9998% (при выявлении мононуклеотидных полиморфизмов).

Было выполнено полноэкзомное секвенирование 48 образцов измененных тканей (24 образцов тканей ЛСОРП и 24 образцов тканей ПРСОРП) с использованием высокопроизводительного секвенатора Illumina Next Seq 550 (Illumina, Inc., США). Данное исследование было выполнено с целью поиска врожденных (герминальных) генетических вариантов («мутаций»), с высокой вероятностью ассоциированных с развитием лейкоплакии СОР и плоскоклеточного рака СОР. Указанные генетические варианты присутствуют в 100% клеток организма, ввиду чего они могут быть выявлены в ДНК лейкоцитов, причем 20-кратного покрытия прочтениями ≥85% секвенируемых последовательностей, обеспечиваемого набором Nextera DNA Exome, достаточно для их надежного выявления и документирования.

Биоинформационный анализ

Биоинформационный анализ результатов экзомного секвенирования ДНК был выполнен с использованием специализированных комплексов программного обеспечения Illumina Base Space (Illumina, Inc., США) и Galaxy Project (The Galaxy Community, некоммерческий международный проект в рамках движения «открытая наука») и в соответствии с актуальными методическими рекомендациями [17–19].

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Единственными предикторами развития ЛСОРП и ПРСОРП, изучаемыми в настоящем исследовании, являются патогенные и вероятно патогенные герминальные генетические варианты, выявляемые в экзоме пациентов с соответствующими заболеваниями. Модификаторами эффекта могут являться патогенные варианты регуляторных генов, а также эпигенетические модификации генов экзома (например, их метилирование), не учитываемые в данном исследовании. Также модификатором эффекта может являться наличие у пациента нескольких патогенных вариантов генов экзома одновременно. Конфаундерами в данном исследовании могут являться неучтенные внешние воздействия (например, привычка курить трубку либо действие вируса папилломы человека), которые могут вызывать дисплазию либо злокачественную трансформацию клеток эпителия СОРП без образования патогенных (онкогенных) вариантов генов экзома, в частности путем их эпигенетических модификаций либо повреждения регуляторных генов.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Расчет должного размера выборки производился исходя из стандартного для биомедицинских исследований уровня вероятности ошибки I рода (α) ≤ 0,05. Желаемая мощность исследования составила 90%. Мы также исходили из предположения, что патогенные генетические варианты, ассоциированные с развитием неоплазм, встречаются в популяции чрезвычайно редко (не чаще чем в 0,001% случаев), в то время как в клетках патологически измененных тканей указанные варианты должны встречаться не реже чем в 30% образцов. Для расчета необходимого размера выборки использовалась функция Sample Size Calculation программы Statistica 12 (Stat Soft, Inc., США) (Two Proportions, Z-test) с установленной опцией «односторонняя гипотеза» (1-tailedhypothesis), поскольку исходно предполагалось, что патогенные (онкогенные) генетические варианты встречаются в ткани лейкоплакий/рака СОРП намного чаще, чем в референсном геноме человека, по которому производилось выравнивание ридов. Подсчитанный таким образом размер выборки составил 23 человека; он был увеличен до 24 человек, т. к. один набор реагентов Nextera DNA Exome позволяет обработать 12 образцов ДНК.

Статистические методы

Статистическая обработка данных выполнялась при помощи специализированных программных пакетов Statistica (версия 12) (StatSoft, Inc., США) и MedCalc (версия 18.9.1) (Med Calc Software Ltd, Бельгия). Центральная тенденция и разброс значений анализируемых количественных показателей описывались в виде медианно-квартильных характеристик: медианы, 25-го и 75-го квартилей. Сравнение категориальных переменных выполнялось с использованием критерия χ ² и точного теста Фишера, выявление статистической значимости различий количественных признаков производилось при помощи U-теста Манна — Уитни. Для выявления генетических вариантов, статистически значимо ассоциированных с развитием плоскоклеточного рака СОР, использовался корреляционный анализ Спирмена (Spearman’s Rho), а также логистический регрессионный анализ. В регрессионный анализ включались показатели с уровнем значимости р ≤ 0,05. Для оценки влияния отдельных генетических вариантов на вероятность развития изучаемой патологии рассчитывались отношения шансов (ОШ) и отношения рисков (ОР), а также их 95% доверительные интервалы (ДИ). Во всех случаях выявленные закономерности считались статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05, при этом оптимальным уровнем значимости, общепризнанным среди биоинформатиков и однозначно указывающим на наличие взаимосвязи между генетическим вариантом и фенотипом, являлся р ≤ 5×10^–8 [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки исследования

В выборку включались пациенты с установленными и подтвержденными диагнозами ЛСОРП и ПРСОРП, обращавшиеся за медицинской помощью в учреждение здравоохранения «Витебский областной клинический стоматологический центр» (ЛСОРП) и в учреждение здравоохранения «Витебский областной клинический онкологический диспансер» (ПРСОРП). Включение пациентов в обе выборки осуществлялось в порядке их обращения при соответствии критериям включения и отсутствии критериев невключения, без каких-либо дополнительных условий. Блок-схема дизайна исследования представлена на рисунке 1.

Характеристики выборки (групп) исследования

Всего в исследование были включены 24 пациента с морфологически верифицированным диагнозом лейкоплакии слизистой оболочки полости рта с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени (15 мужчин, 9 женщин). Средний возраст пациентов составил 59 лет (min — 42 года, max — 72 года, 95% ДИ: 57–65 лет). Во всех случаях имела место плоская форма лейкоплакии, наиболее распространенная в популяции.

Также в исследование были включены 24 пациента с установленным диагнозом рака СОР (13 мужчин, 11 женщин). Средний возраст пациентов составил 60,5 года (min — 38 лет, max — 75 лет, 95% ДИ: 55–65 лет). Во всех случаях имела место первичная опухоль; также у 100% пациентов был диагностирован плоскоклеточный рак.

Основной результат исследования

Оценка качества выполнения полноэкзомного секвенирования

Доля оснований GC в прочитанных генетических последовательностях колеблется от 49 до 51%, составляя в среднем 50%; средняя длина прочтений («ридов») составляет ≈148 оснований, что в наилучшей степени соответствует возможностям прибора Illumina Next Seq 550; средняя доля нуклеотидных последовательностей, прочитанных хотя бы 1 раз, составляет 97,8%, ≥5 раз — 91,8%, ≥10 раз — 83,7%, ≥30 раз — 52,9%, медиана покрытия нуклеотидных последовательностей прочтениями составляет 35,4Х, среднее покрытие — 42,5Х, доля успешно выровненных нуклеотидных последовательностей от общего объема экзома — 99,9%.

С учетом того что в данном случае выполнялось секвенирование ДНК с целью выявления герминальных вариантов, избыточного покрытия последовательностей прочтениями не требуется и наиболее важным показателем из приведенных в таблице для данной ситуации является средняя доля нуклеотидных последовательностей, прочитанных 10 и более раз — она должна быть ≥60% (в нашем случае — 83,7%, что свидетельствует о достаточно высоком качестве полученных нами результатов секвенирования).

Результаты биоинформационного анализа данных полноэкзомного секвенирования образцов крови пациентов

В ходе биоинформационного анализа результатов секвенирования те или иные генетические варианты были выявлены практически в каждом из 24 918 генов экзома человека, которые можно секвенировать при помощи набора Illumina Nextera DNA Exome; общее количество обнаруженных уникальных генетических вариантов составило 124 475 в группе пациентов с ЛСОРП и 152 767 в группе пациентов с ПРСОРП (в среднем по 11 688 мутантных генов и ≈33 600 генетических вариантов у каждого изученного пациента). При этом подавляющее большинство выявленных вариантов нуклеотидных последовательностей не имело клинического значения, существенно не влияя ни на синтез белков, ни на их функцию.

Тем не менее значительное количество вариантов было выявлено в относительно небольшом количестве генов. У пациентов с ЛСОРП это были (в порядке возрастания количества вариантов) гены MAP2K3 (в среднем выявлено 72 варианта), DNAH5 (315 вариантов), HSPG2 (383 варианта), OBSCN (731 вариант), SYNE1 (733 варианта), HLA-DRB1 (766 вариантов), HLA-DQB1 (842 варианта), TTN (911 вариантов), AHNAK2 (1029 вариантов), HLA-A (1038 вариантов), PDE4DIP (1210 вариантов), MUC12 (1293 варианта), MUC3A (1561 вариант), MUC4 (1680 вариантов), MUC16 (1955 вариантов) — всего 14 519 вариантов в 15 генах (рис. 2).

Аналогичная ситуация наблюдалась у пациентов с ПРСОРП: в данной группе варианты наиболее часто обнаруживались в генах MAP2K3 (176 вариантов), MUC17 (206 вариантов), SYNE1 (596 вариантов), PKD1L2 (625 вариантов), AHNAK2 (838 вариантов), HLA-DRB1 (856 вариантов), HLA-B (888 вариантов), HLA-DQB1 (1033 варианта), HLA-A (1057 вариантов), PDE4DIP (1214 вариантов), HLA-DQA1 (1280 вариантов), MUC12 (1299 вариантов), MUC4 (1433 варианта), MUC3A (1539 вариантов), MUC16 (1864 варианта) — всего 14 904 варианта также в 15 генах (рис. 3).

Очевидно, что у пациентов как с ЛСОРП, так и с плоскоклеточным раком СОР наибольшее количество генетических вариантов было выявлено в одних и тех же генах, что указывает на отсутствие существенных различий в локализации герминальных мутаций у данных групп пациентов. Оценка статистической значимости различий частоты встречаемости выявленных вариантов нуклеотидных последовательностей в идентичных генах между группами пациентов с ЛСОРП и ПРСОРП приведена в таблице 1.

Как следует из таблицы 1, в целом перечисленные выше генетические варианты значимо чаще встречаются у пациентов с ЛСОРП, чем в группе пациентов с ПРСОРП, но разница абсолютных и относительных показателей частоты встречаемости герминальных мутаций между представителями данных групп невелика, а статистическая значимость этих различий проистекает из большого общего количества выявленных генетических вариантов, ввиду чего указанная разница почти наверняка не имеет клинической значимости.

Обращает на себя внимание, что в обеих группах пациентов гены с наибольшим количеством выявленных вариантов (44,7 и 41,2% в группах пациентов с ЛСОРП и с ПРСОРП соответственно) — это гены MUC3A, MUC4, MUC12 и MUC16, которые кодируют различные белки-муцины, играющие важную роль в формировании защитных слизистых барьеров на эпителиальных поверхностях, а также участвующие в обновлении и дифференцировке эпителия. Недостаточная продукция либо снижение функциональной активности муцинов может приводить к хроническому повреждению клеток эпителия СОР, что, в свою очередь, может служить триггерным фактором как кератоза (процесса, лежащего в основе лейкоплакий СОР), так и злокачественного перерождения эпителиоцитов [21–23].

Дополнительные результаты исследования

Все результаты, полученные в ходе исследования, были изложены в предыдущих разделах.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Показано, что общее количество уникальных герминальных генетических вариантов в экзоме пациентов с обоими заболеваниями весьма велико — не менее 124 475 в группе пациентов с ЛСОРП и не менее 152 767 — в группе пациентов с ПРСОРП (в среднем по 11 688 измененных генов и ≈33 600 генетических вариантов у каждого изученного пациента). Установлено, что большинство герминальных мутаций у пациентов из изученной выборки (как с ЛСОРП, так и с ПРСОРП) локализовано всего в 19 генах экзома: MAP2K3, DNAH5, HSPG2, OBSCN, SYNE1, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-A, HLA-B, PKD1L2, TTN, AHNAK2, PDE4DIP, MUC3A, MUC4, MUC12, MUC16, MUC17. Наибольшее количество генетических вариантов у пациентов из обеих изученных клинических групп было выявлено в генах MUC3A, MUC4, MUC12 и MUC16, ответственных за синтез семейства гликопротеидов-муцинов (44,7 и 41,2% в группах пациентов с ЛСОРП и с ПРСОРП соответственно). Муцины играют важную роль в формировании защитных слизистых барьеров на эпителиальных поверхностях и участвуют в обновлении и дифференцировке эпителия [24]. Недостаточная продукция либо снижение функциональной активности муцинов может приводить к хроническому повреждению клеток эпителия СОРП, что, в свою очередь, может служить триггерным фактором как кератоза, так и злокачественного перерождения эпителиоцитов [25].

Ограничения исследования

Невозможность существенно увеличить размер изученных выборок пациентов ввиду высокой стоимости исследования, из-за чего выявленные взаимосвязи между патогенными генетическими вариантами генов экзома и развитием ЛСОРП и ПРСОРП могут носить неоднозначный характер. В настоящем исследовании не изучались патогенные варианты регуляторных генов, а также эпигенетические модификации генов экзома на всех уровнях, что исключает анализ влияния указанных феноменов на развитие ЛСОРП и ПРСОРП. Высокая стоимость полноэкзомного секвенирования и сложность биоинформационного анализа полученных данных ограничивают применение использованного метода исследования в клинической практике даже при выявлении однозначных ассоциаций между определенными патогенными вариантами генов экзома и развитием изучаемых заболеваний.

Интерпретация результатов исследования

Предварительный анализ полученных нами результатов показывает, что количество выявленных у пациентов с ЛСОРП и ПРСОРП вариантов генов экзома по сравнению с референсным геномом человека весьма велико, но, вероятно, бóльшая часть этих вариантов относится к доброкачественным и не влияет на развитие изучаемых заболеваний. Тем не менее складывается впечатление, что большое количество выявляемых вариантов генов MUC3A, MUC4, MUC12 и MUC16 неслучайно: данные гены ответственны за образование муцинов, играющих важную роль в формировании защитных слизистых барьеров на эпителиальных поверхностях и участвующих в обновлении и дифференцировке эпителия. Недостаточная продукция либо снижение функциональной активности муцинов может приводить к хроническому повреждению клеток эпителия СОРП, что, в свою очередь, может служить триггерным фактором как для развития кератоза и дисплазии, так и для злокачественного перерождения эпителиоцитов. Для оценки патогенности выявленных генетических вариантов и определения степени их ассоциации с развитием ЛСОРП и ПРСОРП необходим дальнейший биоинформационный анализ полученных данных секвенирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые в Республике Беларусь выполнено высокопроизводительное полноэкзомное секвенирование образцов ДНК, выделенных из крови пациентов с ЛСОРП и ПРСОРП. В результате исследования установлено, что большинство герминальных мутаций у пациентов из изученной выборки локализовано всего в 19 генах экзома, но наибольшее количество генетических вариантов у пациентов из обеих изученных клинических групп было выявлено в генах MUC3A, MUC4, MUC12 и MUC16–44,7 и 41,2% в группах пациентов с ЛСОРП и с ПРСОРП соответственно. Муциновые гены кодируют эпителиальные белки семейства гликопротеидов-муцинов, играющие важную роль в формировании защитных слизистых барьеров на эпителиальных поверхностях, а также участвующие в обновлении и дифференцировке эпителия. Развитие анализируемых патологических процессов в слизистой оболочке ротовой полости может быть ассоциировано с патогенными вариантами таких генов, так как недостаточная продукция либо снижение функциональной активности муцинов может служить триггерным фактором как кератоза, так и злокачественного перерождения эпителиоцитов.