Клиническое значение патогенности соматических мутаций при лейкоплакии слизистой оболочки ротовой полости: проспективное наблюдательное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Подавляющее большинство злокачественных новообразований слизистой оболочки ротовой полости (СОРП) приходится на плоскоклеточный рак. Плоскоклеточный рак СОРП развивается, как правило, в исходе предшествующих потенциально злокачественных заболеваний, ведущим из которых является лейкоплакия [1][2].

В Республике Беларусь исследований молекулярно-генетических механизмов развития лейкоплакии слизистой оболочки ротовой полости (ЛСОРП) не проводилось. Можно предполагать, что существуют региональные особенности генетических вариантов, ассоциированных с развитием ЛСОРП. Знание подобных вариантов позволило бы разработать ПЦР- и NGS-тест-системы для выявления клинически значимых генетических вариантов. Имеющиеся крайне немногочисленные исследования показывают, что в клетках некоторых лейкоплакий были выявлены патогенные мутации гена tp53; они особенно часто обнаруживались при диспластических процессах эпителия и у лиц, курящих и злоупотребляющих алкоголем [3][4]. Есть указания на то, что количество одновременно выявляемых при ЛСОРП мутаций гена tp53 напрямую связано со степенью эпителиальной дисплазии, ввиду чего подобные мутации являются ранними событиями канцерогенеза СОРП [5][6]. Существуют также свидетельства возможной роли мутаций гена NOTCH1 в патогенезе злокачественного перерождения оральных лейкоплакий. Указанные мутации, по данным авторов, обнаруживаются в 60 % случаев предраковых заболеваний эпителия СОРП [6–8]. Общая частота злокачественной трансформации ЛСОРП составляет 3,5 %, однако в различных исследованиях, включенных в обзор, она варьировала от 0,13 до 34 % [9].

Таким образом, ЛСОРП с метаплазией эпителия, являясь предраковыми заболеваниями, представляют большой интерес для здравоохранения ввиду необходимости оценки вероятности их злокачественной трансформации, вследствие чего исследования молекулярно-генетических механизмов формирования лейкоплакий СОРП остаются актуальными.

Цель исследования — определить клиническое значение патогенности соматических мутаций при лейкоплакии слизистой оболочки ротовой полости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проспективное, основанное на наблюдении, поперечное (cross-sectional), без контрольной группы, 24 образца ткани с пораженного участка слизистой оболочки ротовой полости пациентов с морфологически верифицированным диагнозом лейкоплакии слизистой оболочки полости рта с дисплазией эпителия 1-й степени (15 мужчин, 9 женщин).

Условия проведения исследования

Забор ткани слизистой оболочки ротовой полости производился на приеме стоматолога в учреждении здравоохранения «Витебский областной клинический стоматологический центр». Генетическое исследование полученного биологического материала осуществлялось на базе Центра коллективного пользования «Геном» Института генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси с привлечением высококвалифицированных специалистов из лаборатории молекулярной генетики, лаборатории генетики человека и группы биоинформатики данного государственного научного учреждения. Сроки проведения исследования: с апреля 2020 по декабрь 2022 г.

Критерии соответствия

Критерии включения

Пациенты любого пола 18 лет и старше с морфологически верифицированным диагнозом ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени, подписавшие информированное согласие об участии в исследовании.

Критерии невключения

Пациенты моложе 18 лет, беременные женщины, пациенты с тяжелым течением либо декомпенсацией сопутствующих соматических заболеваний, а также пациенты, отказавшиеся подписать информированное согласие об участии в исследовании.

Критерии исключения

Изменение диагноза, выявление беременности либо развитие декомпенсации одного или нескольких сопутствующих соматических заболеваний у пациентов из сформированной выборки, произошедшее в ходе исследования.

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Диагностические критерии для пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки ротовой полости с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени: основной морфологический элемент — бляшка серовато-белого цвета с четкими краями, перламутровым блеском на видимо не измененной СОРП, которая представляет собой неравномерное помутнение эпителия; не выступает над уровнем окружающих участков СОРП; не снимается при поскабливании; слизистая оболочка на участках поражения берется в складку; гистологически — явления гиперкератоза, слабо выраженного акантоза, атипическая трансформация плоскоклеточного эпителия, затрагивающая не более трети его толщины; при люминесцентном исследовании — голубое свечение участка поражения; при оптической когерентной томографии (ОКТ-исследовании) изображение слоистое, дифференцируются два горизонтально ориентированных слоя.

Подбор участников в группы

В ходе исследования было отобрано 24 образца ткани слизистой оболочки ротовой полости с пораженного участка пациентов с лейкоплакией слизистой оболочки ротовой полости.

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

Количество найденных патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов, ассоциированных с развитием ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени.

Дополнительные показатели исследования

Настоящим исследованием не предусмотрены.

Методы измерения целевых показателей

Лабораторные методы исследования

Выделение ДНК из биопсийного материала слизистой оболочки ротовой полости и крови, секвенирование ДНК

Для выделения ДНК использовали набор QIAamp DNA FFPE TissueKit (Qiagen, Германия). Все операции по экстракции ДНК из биологических образцов и подготовке ДНК-библиотек к секвенированию выполняли пошагово в строгом соответствии с инструкциями по применению, прилагаемыми производителем (QIAGEN, Германия) к набору реагентов для экстракции ДНК QIAamp DNA FFPE TissueKit¹. Таргетное ДНК-секвенирование выполняли при помощи высокопроизводительного секвенатора Illumina NextSeq 550 с применением набора реагентов для таргетного секвенирования TruSight™ Oncology 500 DNA Kit, For Use with NextSeq (48 samples), который позволяет устанавливать первичные нуклеотидные последовательности 523 генов, ассоциированных с канцерогенезом. Процедура секвенирования выполнялась пошагово в строгом соответствии с инструкцией, прилагаемой производителем к набору реагентов TruSight™ Oncology 500 DNA Kit, For Use with NextSeq (48 samples) (Illumina, Inc., США)².

Выполнение биопсии СОРП

Перед проведением биопсии проводили инфильтрационную анестезию препаратами артикаина гидрохлорид (40 мг/1 мл) + эпинефрин (0,005 мг/1 мл), вводя 0,3–1 мл анестетика под неизмененную слизистую оболочку на расстоянии 2–3 мм от элемента поражения на глубину приблизительно 2 мм, и продвигали иглу под элементом поражения под слизистой оболочкой на протяжении 5 мм, приподнимая за счет давления анестетика пораженного участка СОРП на 1–3 мм. Иссечение участка СОРП осуществляли скальпелем двумя сходящимися полуовальными разрезами. Размер биоптата зависел от размера очага поражения. При невозможности получения полноценного биоптата пациента исключали из исследования. Биоптат СОРП делили на две равные части, одну из которых погружали в 10 % забуференный формалин (для получения гистологических и иммуногистохимических препаратов), а вторую переносили в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл, заполненную буфером-стабилизатором нуклеиновых кислот VXL (Qiagen, Германия), инактивирующим нуклеазы, после чего транспортировали в молекулярно-генетическую лабораторию для экстракции ДНК. Послеоперационная рана промывалась раствором антисептика, накладывались 2–3 отдельных узловых шва.

Биоинформационный анализ

Биоинформационный анализ результатов ДНК-секвенирования был выполнен с использованием специализированных комплексов программного обеспечения Illumina Base Space (Illumina, Inc., США) и Galaxy Project (The Galaxy Community, некоммерческий международный проект) и в соответствии с актуальными методическими рекомендациями [10–12].

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Единственными предикторами развития ЛСОРП, изучаемыми в настоящем исследовании, являются патогенные и вероятно патогенные соматические генетические варианты, выявляемые в ткани пациентов с ЛСОРП. Модификаторами эффекта могут являться патогенные варианты регуляторных генов, а также эпигенетические модификации генов (например, их метилирование), не учитываемые в данном исследовании. Также модификатором эффекта может являться наличие у пациента нескольких патогенных вариантов генов одновременно. Конфаундерами в данном исследовании могут являться неучтенные внешние воздействия (например, действие вируса папилломы человека или привычка курить трубку), которые могут вызывать злокачественную трансформацию клеток эпителия без образования патогенных вариантов генов, в частности путем их эпигенетических модификаций либо повреждения регуляторных генов.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Расчет должного размера выборки производился исходя из стандартного для биомедицинских исследований уровня вероятности ошибки I рода (α) ≤ 0,05. Желаемая мощность исследования составила 90 %. Мы также исходили из предположения, что патогенные генетические варианты, ассоциированные с развитием неоплазм, встречаются в клетках патологически измененных тканей. Указанные варианты должны встречаться не реже чем в 30 % образцов. Для расчета необходимого размера выборки использовалась функция Sample Size Calculation программы Statistica 12 (StatSoft, Inc., США) (Two Proportions, Z-test) с установленной опцией «односторонняя гипотеза» (1-tailed hypothesis), поскольку исходно предполагалось, что патогенные (онкогенные) генетические варианты встречаются в ткани лейкоплакий СОРП намного чаще, чем в референсном геноме человека, по которому производилось выравнивание рядов. Подсчитанный таким образом размер выборки составил 23 пациента; он был увеличен до 24 человек, так как такой размер выборки лучше соответствовал возможностям использованного нами набора реагентов для таргетного секвенирования Tru Sight™ Oncology 500 DNA Kit, For Use with NextSeq (48 samples).

Статистические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки исследования

В выборку включались пациенты с установленными и подтвержденными диагнозами ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени, обращавшиеся за медицинской помощью в учреждение здравоохранения «Витебский областной клинический стоматологический центр». Включение пациентов осуществлялось в порядке их обращения при соответствии критериям включения и отсутствии критериев невключения, без каких-либо дополнительных условий. Блок-схема дизайна исследования представлена на рисунке.

Характеристики выборки (групп) исследования

Всего в исследование были включены 24 пациента с морфологически верифицированным диагнозом лейкоплакии слизистой оболочки полости рта с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени (15 мужчин, 9 женщин). Средний возраст пациентов составил 59 лет (min — 42 года, max — 72 года, 95 % ДИ: 57–65 лет).

Основные результаты исследования

Оценка качества выполнения таргетного секвенирования

Доля оснований GC в распознанных генетических последовательностях колеблется от 50 до 56 %, составляя в среднем 52,5 %; средняя длина ридов ≈108 оснований, что соответствует возможностям прибора Illumina NextSeq 550 и особенностям использованной тест-системы Tru Sight™ Oncology 500 DNA Kit, For Use with NextSeq (48 samples); медиана покрытия нуклеотидных последовательностей прочтениями составляет 462Х, среднее покрытие — 584,4Х, доля успешно выровненных нуклеотидных последовательностей от общего объема сиквенса — 100 %. С учетом того что целью настоящего исследования являлось выявление соматических мутаций, для надежного их обнаружения необходимо избыточное покрытие нуклеотидных последовательностей прочтениями (минимально достаточное — 300Х, оптимальное — не менее 500Х); видно, что в ходе секвенирования были достигнуты оптимальные показатели кратности покрытия нуклеотидных последовательностей прочтениями.

Средняя доля нуклеотидных последовательностей, прочитанных хотя бы 1 раз, составляет 99,7 %, ≥5 раз — 99,5 %, ≥10 раз — 99,2 %, ≥30 раз — 97,6 %, ≥50 раз — 95,6 %. Важным показателем качества таргетного секвенирования является средняя доля нуклеотидных последовательностей, прочитанных 30 и более раз — она должна быть не ниже 95 % [14]. В нашем случае указанный показатель равен 97,6 %, что свидетельствует о достаточно высоком качестве полученных нами результатов таргетного секвенирования.

Результаты биоинформационного анализа данных таргетного секвенирования образцов ткани пациентов с ЛСОРП

В ходе биоинформационного анализа результатов таргетного секвенирования 24 образцов тканей ЛСОРП с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени нами было выявлено 2439 видов генетических вариантов. Из них 13 разновидностей генетических вариантов (0,53 %) являлись патогенными или вероятно патогенными; еще 1280 генетических вариантов (52,48 %) имели неопределенное клиническое значение; наконец, оставшиеся 1146 генетических вариантов (46,99 %) были доброкачественными.

Выявленные патогенные и вероятно патогенные генетические варианты перечислены и охарактеризованы в таблице 1.

Генетические варианты, расцененные как патогенные и вероятно патогенные, затрагивают в первую очередь гены, ответственные за реализацию различных сигнальных путей, регуляцию процессов транскрипции и клеточного апоптоза. При этом общее количество патогенных и вероятно патогенных соматических мутаций всех типов, выявленных в образцах тканей ЛСОРП, отобранных у пациентов из изученной выборки, составило всего 24. Так, у 6 пациентов не было выявлено ни одного патогенного генетического варианта, у 15 пациентов было выявлено по 1 патогенному генетическому варианту и у 3 пациентов имелось по 2 патогенных генетических варианта (медиана — 1). Факт отсутствия патогенных соматических мутаций в части образцов тканей ЛСОРП можно объяснить как случайностью (например, в конкретном образце преобладали нормальные клетки с неизмененным генотипом, в частности, интактные эпителиальные клетки), так и особенностями использованного для таргетного секвенирования набора реагентов. Как указывалось ранее, набор Tru Sight™ Oncology 500 DNAKit, For Use with NextSeq (48 samples) предназначен для секвенирования 523 генов, которые, по данным ранее проведенных исследований, ассоциированы с патогенезом различных злокачественных новообразований.

Тем не менее нельзя исключить вероятность того, что соматические мутации, ответственные за формирование дисплазии эпителия при ЛСОРП, могут располагаться в каких-либо иных генах, которые не могли быть секвенированы с использованием вышеупомянутого набора. Помимо этого, ЛСОРП, будучи доброкачественными образованиями, теоретически могут формироваться под влиянием различных эпигенетических факторов, в частности, инактивации генов без нарушения их целостности (например, путем прямого метилирования ДНК либо подавления трансляции вследствие взаимодействия иРНК с микроРНК), альтернативного сплайсинга либо посттрансляционных модификаций белков, что не представлялось возможным проверить в рамках настоящего исследования.

С целью увеличения числа потенциальных патогенных генетических вариантов нами был проведен поиск в базе данных ClinVar, содержащей сведения о выявленных ассоциациях между какими-либо генетическими вариантами и различными заболеваниями [15][16], и было вручную отобрано еще 14 генетических вариантов с неопределенной патогенностью, про которые имелась информация, что они могут быть связаны с развитием каких-либо онкологических заболеваний. Указанные генетические варианты перечислены и охарактеризованы в таблице 2.

Даже с учетом 14 дополнительных генетических вариантов у 4 пациентов не было выявлено никаких патогенных и вероятно патогенных соматических мутаций — по крайней мере, в 523 генах, секвенирование которых может быть выполнено с использованием набора реагентов Tru Sight™ Oncology 500 DNAKit, For Use with NextSeq (48 samples).

В таблице 3 приведена информация о частоте встречаемости отобранных нами патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов в человеческой популяции по данным gnomAD, а также отношения шансов (ОШ) и рисков (ОР), указывающие на возможную взаимосвязь отдельных соматических мутаций с развитием лейкоплакий СОР.

Как следует из таблицы 3, варианты генов ALK и MET, выявленные в настоящем исследовании, встречаются в популяции очень часто (это особенно справедливо для варианта g.29193615T>C гена MET, которая встречается у трети населения земного шара, ввиду чего с очень высокой вероятностью является доброкачественной), вследствие чего разница между частотами их встречаемости в изученной выборке пациентов с ЛСОРП и в генеральной совокупности статистически незначима; соответственно, данные генетические варианты не могут быть ассоциированы с ЛСОРП.

Напротив, выявленные в нашем исследовании генетические варианты генов TP53 (n = 11), KRAS (n = 10), APC (n = 3), NRAS (n = 2) и BRAF (n = 2) очень редко (тысячные доли процента) встречаются в человеческой популяции, ввиду чего частоты их встречаемости в изученной выборке в тысячи и десятки тысяч раз превышают таковые в генеральной совокупности, причем указанная разница статистически значима. Таким образом, можно с высокой вероятностью предположить, что выявленные в ходе настоящего исследования соматические мутации в генах TP53, KRAS, APC, NRAS и BRAF как поодиночке, так и в сочетаниях ассоциированы с развитием дисплазии при ЛСОРП.

Дополнительные результаты исследования

Все результаты, полученные в ходе исследования, были изложены в предыдущих разделах.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Можно с высокой вероятностью предположить, что выявленные в ходе настоящего исследования соматические мутации в генах TP53, KRAS, APC, NRAS и BRAF как поодиночке, так и в сочетаниях ассоциированы с развитием лейкоплакий СОР.

Множественность патогенных и вероятно патогенных генетических вариантов, ассоциированных с дисплазией эпителия, а также то, что ряд вариантов имеет место не у всех пациентов в изученной выборке, позволяет предположить, что один и тот же гистотип дисплазии СОРП может развиваться под воздействием различных приобретенных патогенных мутаций, каковой феномен уже был описан многими исследователями для ряда других онкологических заболеваний [16–18].

Обращает на себя внимание, что гены TP53, KRAS, APC, NRAS и BRAF отвечают за реализацию различных сигнальных путей, регуляцию процессов транскрипции и клеточного апоптоза; так, например, ген ТР53 — ключевое звено сигнального пути р53, ответственного за регуляцию клеточного цикла. Соответственно, нарушения транскрипции и/или трансляции данных генов вследствие соматических мутаций могут лежать в основе онкогенеза.

Ограничения исследования

Невозможность существенно увеличить размер изученной выборки пациентов ввиду высокой стоимости исследования, из-за чего выявленные взаимосвязи между патогенными генетическими вариантами соматических мутаций и развитием ЛСОРП могут носить неоднозначный характер. В настоящем исследовании не изучались патогенные варианты регуляторных генов, а также эпигенетические модификации генов на всех уровнях, что исключает анализ влияния указанных феноменов на развитие ЛСОРП. Высокая стоимость таргетного секвенирования и сложность биоинформационного анализа полученных данных ограничивают применение использованного метода исследования в клинической практике даже при выявлении однозначных ассоциаций между определенными патогенными вариантами генов и развитием дисплазии при ЛСОРП.

Интерпретация результатов исследования

Качество выполненного нами таргетного секвенирования образцов ДНК, выделенных из патологически измененных тканей лейкоплакий СОР, достаточно высоко для уверенного выявления соматических мутаций, встречающихся в ≤10 % клеток анализируемого образца, что удовлетворяет цели и задачам настоящего исследования.

Количество выявленных у пациентов с ЛСОРП вариантов соматических мутаций генов по сравнению с референсным геномом человека весьма велико, но, вероятно, бóльшая часть этих вариантов относится к доброкачественным и не влияет на развитие изучаемых заболеваний. Тем не менее выявленные в ходе настоящего исследования патогенные и вероятно патогенные варианты генов TP53, KRAS, APC, NRAS и BRAF как поодиночке, так и в сочетаниях с высокой вероятностью ассоциированы с лейкоплакиями СОР с плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазией эпителия 1-й степени. В первую очередь это касается патогенных и вероятно патогенных вариантов генов KRAS и TP53 ввиду наличия большого разнообразия указанных вариантов, а также их значительной распространенности в изученной выборке пациентов с ЛСОРП.

Взаимосвязь патогенных генетических вариантов именно генов TP53, KRAS, APC, NRAS и BRAF с развитием плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии эпителия 1-й степени неслучайна: данные гены отвечают за реализацию различных сигнальных путей, участвующих в обновлении и дифференцировке эпителия, регуляции процессов транскрипции и клеточного апоптоза. Соответственно повреждение указанных генов может являться триггерным фактором как для развития кератоза и дисплазии, так и для злокачественного перерождения эпителиоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленные в настоящем исследовании патогенные и вероятно патогенные варианты генов:

TP53 (17:g.7673803G>A, 17:g.7675088C>T,

17:g.7674220C>T, 17:g.7675085C>A, 17:g.7673704G>A, 17:g.7673717TG>T, 17:g.7670685G>A, 17:g.7674894G>A, 17:g.7673824C>T);

KRAS (12:g.25245347C>T, 12:g.25245350C>T, 12:g.25245350C>A, 12:g.25245351C>A, 12:g.25245284G>T),

APC (5:g.112839606C>T, 5:g.112828889C>T, 5:g.112839942C>T);

NRAS (1:g.114716126C>T, 1:g.114713908T>A)

и BRAF (7:g.140753336A>T) как поодиночке, так и в сочетаниях с высокой вероятностью (ОР 3000–11 000) ассоциированы с развитием ЛСОРП с дисплазией эпителия 1-й степени.