Морфологическая оценка экспрессии актина и десмина при различных сроках холодовой ишемии миокарда: наблюдательное исследование

ВВЕДЕНИЕ

На сегодня одной из основных проблем мирового здравоохранения является терминальная сердечная недостаточность, ведущим методом лечения которой остается трансплантация сердца (ТС) [1]. Вопрос острого отсутствия донорских органов при повышении необходимости в ТС указывает на неизбежность расширения признаков выбора доноров, среди которых одним из важнейших является время ишемии донорского сердца. Повышение продолжительности данного показателя до более 240 минут, по мнению некоторых авторов, увеличивает опасность развития нарушения деятельности трансплантата и может привести к летальному исходу [2][3].

В то же время нормотермическое ишемическое повреждение миокарда сопряжено с разрушающим влиянием гипоксии на структуры клеточных белков, составляющих клеточный каркас кардиомиоцитов. Актин, представляющий неотъемлемую часть микрофиламентов совместно с белком миозином, создает сократительные элементы мышц — актомиозиновые комплексы саркомеров. Ослабление интенсивности саркомерного актина в цитоплазме мышечных клеток в участке повреждения указывает на уменьшение сократительной функции кардиомиоцитов¹ [4]. Следующим представителем ведущих структурных белков мышечных клеток является десмин [5][6], который связывает элементы цитоплазмы, создавая матрикс около Z-диска саркомера, и прикрепляет его к цитоплазматической зоне мембраны кардиомиоцита [7][8], соединяя как рядом располагающиеся миофибриллы, так и Z-диски [9][10]. Для сохранения продольной нагрузки во время сокращения десмин посредством собственного контакта с саркомером связывает сократительную часть с ядром клетки, органеллами в цитоплазме клеток, обеспечивающих клеточное дыхание, и постсинаптическим участком [11][12]. Данный механизм, вероятнее всего, связан как с нарушением пути фосфорилирования с последующим разрушением соединенных с ними белков цитоскелета кардиомиоцитов, так и увеличением количества ионов кальция и водорода в клетках, влекущего за собой инициирование действия кальцийзависимых протеаз с дальнейшим распадом актина и десмина.

В части исследований отмечается, что продолжительный срок холодовой ишемии трансплантата не может быть фактором его дисфункции и не оказывает какого-либо влияния на результаты хирургического лечения [3][13]. Констатация повреждения сердечной мышцы методом светооптической микроскопии связана с определенными сложностями, если со времени ее начала проходит небольшой срок. В практической деятельности для диагностики повреждений миокарда актуально применение иммуногистохимического метода или микроскопии в поляризованном свете [10][14–16], позволяющих при изучении участков ишемии миокарда дать заключение о статусе макромолекулярной структуры мышечных клеток сердца.

Цель исследования — провести сравнительную оценку особенностей патоморфологии кардиомиоцитов и экспрессии белков-маркеров — актина и десмина в миокарде донорского сердца перед выполнением основного этапа операции ортотопической трансплантации сердца.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Работа выполнена по дизайну наблюдательного клинического исследования. В исследование включены 17 образцов миокарда ушка левого предсердия донорского сердца (УЛП). Исследование носило проспективный характер.

Условия проведения исследования

Исследование проводилось на базе федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е. Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Трансплантация сердца была выполнена по классической бикавальной технологии. Изъятие сердца выполнялось стандартным методом с консервацией холодным кардиоплегическим раствором Bretschneider (Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Германия). В ряде случаев использовались донорские сердца из отдаленных регионов: Алтайский край, Кемеровская область.

Критерии соответствия

Критерии включения

Сердца от доноров возрастом до 60 лет. Отсутствие травмы грудной клетки, длительных гипотензии и гипоксемии, стабильная гемодинамика, среднее артериальное давление (САД) >60 мм рт. ст., центральное венозное давление (ЦВД) от 8 до 12 мм рт. ст., инотропная поддержка менее 10 мг/кг/мин (допамин), электрокардиография (ЭКГ) и эхокардиография (эхо-КГ) без патологических изменений.

Критерии невключения

Возраст доноров младше 18 лет. Сложные нарушения ритма сердца, необходимость в чрезмерной инотропной поддержке (допамин в дозе 20 мкг/кг/мин или аналогичных дозах другими адренергическими препаратами несмотря на агрессивную оптимизацию пред- и постнагрузки), нарушения сократимости по данным эхокардиографии или фракция выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) <40 %, несмотря на оптимизацию гемодинамики инотропными препаратами.

Критерии исключения

Прижизненный отказ пациента от изъятия внутренних органов.

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Отбор доноров для участия в исследовании включал установление смерти головного мозга на основании клинической картины, результатов лабораторных и инструментальных исследований, которые проводились коллегиально в соответствии с Национальными рекомендациями и принятыми клиническими протоколами².

Подбор участников в группы

Подбор участников в группы проводился в соответствии с длительностью холодовой ишемии трансплантата, предшествующей операции. В первую группу вошли 10 случаев с холодовой ишемией трансплантата до 240 минут, во вторую группу — 7 случаев с холодовой ишемией трансплантата более 240 минут.

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

В миокарде УЛП донорского сердца определяли характер патоморфологической перестройки в условиях различной длительности холодовой ишемии.

Дополнительные показатели исследования

Не предусмотрены.

Методы измерения целевых показателей

В условиях операционного блока во время проведения основного этапа операции забирались образцы миокарда ушка левого предсердия донорского сердца после холодовой ишемии раствором Bretschneider (Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Германия). Фиксацию кусочков миокарда, его гистологическую проводку и последующую окраску гематоксилином-эозином проводили в соответствии с имеющимися рекомендациями. Изучение изготовленных микропрепаратов выполняли на универсальном микроскопе Axio Scope.A1 (Zeiss, Германия), оснащенном анализатором и поляризатором, с фотокамерой AxioCam MRc5 (Zeiss, Германия) и программным обеспечением ZEN blue (Zeiss, Германия). Окрашивание срезов миокарда для проведения иммуногистохимического анализа осуществляли согласно имеющимся предложениям фирмы производителя антител и эталонам, изложенным в руководствах по иммуногистохимическим исследованиям [15]. Срезы депарафинизировали, демаскировку антигенов тканей проводили в PT Link модуле (DAKO, Дания) в цитратном буфере (pH 6,0) при температуре 95 °C в течение 60 минут. Блокировку эндогенной пероксидазы выполняли 3 % раствором Н₂О₂ с последующим протеиновым блоком сывороткой. Далее полученные срезы инкубировали с антителами к Actin, Muscle Specifi c Ab-4 (HHF35); к Desmin 43/GJA1 (клон D33, mоuse monoclonal, DAKO, Дания). Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой (EnVision FLEX, DAKO, Дания). На заключительном этапе выполняли докрашивание ядер клеток гемато­ксилином.

Морфометрия осуществлялась с применением программы «ImageJ 1,48v» (США). При анализе содержания актина, десмина площадь DAB-позитивных продуктов иммуногистохимической реакции оценивали как процент площади изображения. Объемная плотность (Vv, %) иммуногистохимически выявляемого актина и десмина определялась по 20 изображениям с увеличением 40×10. Для изучения интенсивности степени иммунной реакции использовали полуколичественный метод: (+/+++) c подсчетом числа клеток в случайно выбранных 25 полях зрения (100 %): (–) отсутствие окрашивания; (+) слабая — при окрашивании только цитоплазмы клеток; (++) умеренная — при окрашивании цитоплазмы клеток и очаговом окрашивании внеклеточных компонентов <50 %); (+++) выраженная экспрессия — при окрашивании как цитоплазмы клеток, так и большей части внеклеточных компонентов, >50 % (Ю. В. Лискова (2018)) [17]. Типы контрактурных повреждений миокарда оценивали методом поляризационной микроскопии [18].

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Искажающим фактором, способным самостоятельно влиять на результат исследования, могла являться предшествующая врожденная или приобретенная патология сердца. Данный фактор был нивелирован на этапе формирования выборок за счет внесения их в состав критериев невключения.

Статистические процедуры

Принцип расчета размера выборки

Размер выборки предварительно не рассчитывался.

Статистические методы

Статистический анализ полученных результатов проведен с использованием пакета статистических программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc., США). Количественные переменные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха Me [Q1; Q3], качественные переменные — в виде частоты встречаемости и/или процентного отношения. Межгрупповое сравнение показателей производили по критерию Манна — Уитни или с помощью точного критерия Фишера. Значение р < 0,05 считали статистически значимым для всех видов анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки исследования

Для проведения исследования были сформированы две группы: первая группа — 10 случаев с холодовой ишемией трансплантата до 240 минут — 140 [ 140; 150] минут и вторая группа — 7 случаев с холодовой ишемией трансплантата более 240 минут — 375 [ 245; 375] минут (р ≤ 0,05) (рис. 1).

Характеристики выборки (групп) исследования

Пациенты, включенные в первую и вторую группы, были сопоставимы по среднему возрасту и антропометрическим показателям. Средний возраст в 1-й группе составлял 50 [ 44; 59] лет, во 2-й группе — 50 [ 49; 50] лет, р = 0,193. Средний индекс массы тела (ИМТ) в 1-й группе был 25 [ 22; 27] и во 2-й группе 25 [ 21; 31], р = 0,288. В обеих группах отмечено преобладание пациентов мужского пола: 1-я группа 8 (80 %) и 2-я группа 6 (85,7 %) человек, р = 0,256.

Основные результаты исследования

В исследовании материала, взятого у пациентов первой группы, в препаратах миокарда УЛП, окрашенных гематоксилином и эозином, в строме определялись характерные черты фрагментации отдельных мышечных волокон и признаки неравномерного полнокровия сосудов с умеренно выраженным межмышечным отеком, зонами эритроцитарных сладжей в сосудах микроциркуляторного русла. Отмечался спазм мелких артерий с расширением и полнокровием вен. В части сосудов встречали палочковидное удлинение эндотелиоцитов. В целом бóльшая часть кардиомиоцитов сохраняла правильное строение со слабовыраженным признаком неравномерного оксифильного окрашивания, характерного для клеток с контрактурой миофибрилл (рис. 2).

Использование метода поляризационно-микроскопического исследования показало наличие контрактурных изменений в мышечных клетках УЛП как 1-й, так и 2-й группы. В основном такие изменения не превышали уровня субсегментарных (сокращения отдельных групп саркомеров миофибрилл кардиомиоцитов) и сегментарных контрактур I–II степени (которая захватывают всю мышечную клетку) и характеризовались усилением анизотропии диска А, саркомеров с укорочением различной степени изотропных I дисков (рис. 3). Кардиомиоциты со слившимися между собой дисками А в виде гомогенной анизотропии (контрактура III степени) были единичные в обеих группах.

При исследовании экспрессии актина и десмина было выявлено, что бóльшая часть мышечных клеток разделена между собой вставочными дисками с четкими очертаниями и сохранением интенсивной околодисковой ее активности в виде проявившегося в ходе проведения иммуногистохимической реакции темно-коричневого окрашивания. В целом цитоплазма была однородного светло-коричневого цвета с усилением интенсивности реакции в области Z-полос (рис. 4 А, Б). Сохранение равномерного окрашивания актина и десмина в КМЦ как в самой цитоплазме, так и в области вставочных дисков, характеризующих как цитоскелет саркомера, так и внесаркомерный цитоскелет, ассоциированный с сарколеммой, свидетельствует о достаточной защищенности миокарда при длительной его ишемии. При незащищенном миокарде длительная ишемия приводят к диссоциации актинового цитоскелета от мембраны кардиомиоцита, после чего наступает дегенерация и апоптоз клеток, которого в нашем исследовании не наблюдалось.

При гистологическом исследовании в материале, взятом у пациентов 2-й группы при холодовой ишемии миокарда более 240 минут, наблюдалось некоторое расширение околососудистых пространств с отеком стенок интрамуральных артерий с сохранением в части из них паретических изменений с полнокровием и расширением просвета венозного русла. В части артерий отмечались спастические изменения с сужением их просвета, эндотелиальная выстилка сохраняла свою целостность. В сосудах микроциркуляторного русла местами отмечались эритроцитарные сладжи. Мышечные волокна в основном были однородны по диаметру со слабовыраженным неравномерным оксифильным окрашиванием КМЦ, только местами появлялись отдельные волокна с их истончением и волнообразностью контура. В кардио­миоцитах встречался цитоплазматический отек, который сопровождался неравномерной ее окрашенностью. Наряду с контрактурными изменениями мышечных клеток в поляризованном свете, которые не превышали уровня субсегментарных и сегментарных контрактур I–II степени, фиксировался другой вид изменений кардиомиоцитов — внутриклеточный миоцитолизис. Он характеризовался ослаблением анизотропии дисков А или отсутствием анизотропных структур в пределах отдельных мышечных клеток за счет исчезновения той или иной части миофибрилл. Сохранившиеся миофибриллы выступали в виде слабых анизотропных включений (рис. 5).

При иммуногистохимическом исследовании экспрессия актина и десмина в виде реакции светло-коричневого окрашивания цитоплазмы кардиомиоцитов в целом не изменилась, а в части участков несколько увеличилась. В некоторых полях зрения было зарегистрировано уменьшение вставочных дисков с появлением в некоторых из них деформаций в виде «ломаной полосы», местами отмечались легкая размытость поперечной исчерченности и умеренные изменения структуры цитоплазмы мышечных клеток (рис. 6 А, Б).

Таким образом, проведенный иммуногистохимический анализ, направленный на изучение экспрессии актина и десмина, показал, что в обеих исследуемых группах кардиомиоциты УЛП имеют однородную реакцию окрашивания светло-коричневого цвета с резкими ее перепадами до темно-коричневого цвета в местах вставочных дисков мышечных клеток и на протяжении всего мышечного волокна в области Z-полос.

В разные временные промежутки холодовой ишемии (до 240 минут и более 240 минут) в миокарде прослеживается достаточно стабильная морфологическая динамика уровня экспрессии актина и десмина по показателю объемной плотности. Проведенное определение данного показателя в срезах миокарда УЛП в сравнении 1-й и 2-й групп показало его небольшое, но статистически значимое увеличение во 2-й группе: десмина в 1,13 раза, актина в 1,07 раза (табл.), которое может быть связано с продолжающимся набуханием мышечных клеток вследствие появления лизисных изменений миофибрилл, а также с отсутствием клеточно-интерстициального обмена при тотальной холодовой ишемии миокарда. При сравнении двух групп холодовой ишемии (до 240 минут и более 240 минут) по уровню интенсивности экспрессии актина и десмина морфологическая динамика была противоположна. Если показатель иммуногистохимически выявляемого актина и десмина увеличивался одновременно, то значение показателя интенсивности экспрессии по ним носило разнонаправленный характер. Интенсивность экспрессии десмина уменьшалась в 1,6 раза за счет увеличения КМЦ со слабым уровнем интенсивности. Напротив, интенсивность экспрессии актина увеличивалась в 1,5 раза за счет увеличения КМЦ с умеренным и выраженным уровнем интенсивности иммуногистохимической реакции (табл. 1). Такое разнонаправленное изменение показателя интенсивности экспрессии изучаемых клеточных белков может быть связано для актина с сократительной структурой мышечной клетки — саркомером, являющимся основной структурной единицей сердечной мышцы и играющим важную роль в эффективной регуляции сердечного ритма и поддержания гемодинамики, а для десмина — с участием только компартментов вне саркомерного цитоскелета, обеспечивающих физическую поддержку и структурную целостность клеток сердца.

Дополнительные результаты исследования

Дополнительные результаты в ходе исследования не получены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Комплексный морфологический подход к оценке состояния сердечной мышцы ушка левого предсердия показал стабильность экспрессии актина и десмина у пациентов с холодовой ишемией миокарда до 240 минут и более 240 минут. Развивающиеся структурные изменения в виде контрактур не превышали I–II степени. Лизисные изменения отмечены в отдельных КМЦ пациентов второй группы.

Ограничения исследования

Результаты настоящего исследования были получены на небольших выборках пациентов. Для дальнейшего развития выполненной работы необходимо проведение исследования с бóльшим объемом выборки.

Интерпретация результатов исследования

Изучению характера клеточного ответа при повреждении молекулярных структур клетки, реализующих взаимодействие ее мембраны с внутриклеточными элементами, входящими в структуру цитоскелета, посвящен ряд научных работ [19–22]. Структура кардиомиоцитов, включая порядок положения в ней клеточных белков, строго детерминирована. Клеточные белки обладают полифункциональностью, выполняя различные функции и взаимодействуя с различными структурами внеклеточного и внутриклеточного пространства. Это позволяет им обеспечивать сохранность клетки и ее стабильную работу в течение сердечных циклов. Взаимодействуя с компонентами внеклеточной матрицы, клеточные белки обеспечивают механическую прочность и поддержку клеток, помогают в формировании и стабилизации тканевых структур. Внутри клетки белки взаимодействуют с различными органеллами, тем самым осуществляют регуляцию клеточного обмена веществ, энергетического обеспечения клетки, транспорта и сортировки белков, а также сигнальных путей внутри клетки [21–26]. В литературных источниках заболевания сердца, при которых прослеживаются повреждения структуры мышечных клеток, представлены большей частью кардиомиопатиями [23]. Использование иммуногистохимического метода в диагностике повреждения молекулярных структур клетки позволяет оценить как динамику изменения их количества, так и степень целостности кардиомиоцитов.

Изучение экспрессии актина и десмина при исследовании миокарда в условии холодовой ишемии показало ее разнонаправленность по группам. Интенсивность экспрессии десмина с увеличением длительности ишемии уменьшалась (по балльной шкале оценки достоверно увеличивалась группа с характеристикой в один балл) (табл. 1). Достоверное снижение экспрессии десмина при различных формах ишемического повреждения миокарда отмечено во многих исследованиях.

Ишемическое повреждение миокарда приводит к нарушению кровоснабжения сердца и последующей гибели кардиомиоцитов. Это может вызывать изменение экспрессии разных белков, включая десмин. Исследования, использующие методы иммуногистохимии, иммуноблоттинга и другие методы, также подтверждают, что при ишемическом повреждении миокарда происходит снижение экспрессии десмина, что связано с активацией патологических сигнальных путей, изменением генной экспрессии и другими механизмами. Снижение экспрессии десмина при ишемическом повреждении миокарда имеет важные последствия для структуры и функции сердечной мышцы. В таких условиях уменьшение уровня десмина приводит к нарушению целостности клеток, дезорганизации саркомеров и других структурных компонентов. Однако необходимо отметить, что характер и степень изменения экспрессии десмина могут различаться в разных стадиях и формах ишемического повреждения миокарда. Так, И. В. Заднипряный и др. (2017) указывают на достоверное снижение экспрессии десмина при различных формах ишемического повреждения миокарда, но при этом отмечают гетерогенность его присутствия на различных участках: от полного отсутствия реакции кардиомиоцитов на десмин до ее усиления в области Z-полос и вставочных дисков [27].

Наше исследование при длительной тотальной ишемии миокарда УЛП в условиях холодовой ишемии также показало разную интенсивность экспрессии в обеих группах, но при этом участков полного отсутствия реакции на десмин не было. Интенсивность экспрессии актина в отличие от десмина увеличивалась у пациентов 2-й группы (табл. 1) и была неравномерной. Учитывая, что в условиях холодовой тотальной ишемии миокарда восстановление поврежденных миофибрилл путем активации синтетических процессов невозможно, следует предположить иной механизм усиления экспрессии актина, связанный с повышением доступности реактивных групп в актиновых нитях в условиях денатурации белков при развитии смешанных повреждений в виде контрактур и миоцитолизиса [19]. Возможно, это связано и с включением дополнительных рецепторов при фрагментации контрактур, спирально скрученных актиновых нитей в очагах пересокращения и перерастяжения миофибрилл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование выявило, что холодовая ишемия миокарда раствором Bretschneider вследствие наличия в его составе сбалансированных компонентов, обусловливающих метаболическую защиту клеток и их ионный баланс, позволяет обеспечить эффективную защиту донорского сердца в условиях его транспортировки с временем ишемии миокарда продолжительностью как до 240 мин, так и более 240 мин. Комплексный морфологический подход к оценке состояния сердечной мышцы ушка левого предсердия у пациентов с холодовой ишемией миокарда до 240 минут и более, включающий применение световой, поляризационной микроскопии, а также иммуногистохимического исследования, показал стабильность экспрессии актина и десмина в миокарде, что указывает на обратимость структурных изменений в виде развития контрактур не более I–II степени. Появление лизисных изменений в отдельных КМЦ только во второй группе, сохранение экспрессии актина и десмина в обеих группах при их средней интенсивности в обеих группах позволяет судить о достаточно высокой степени сохранности их макромолекулярной структуры для восстановления адекватной сердечной деятельности после трансплантации сердца.