Гемодинамические типы кожной микроциркуляции крыс: выборочное экспериментальное диагностическое исследование

ВВЕДЕНИЕ

Микроциркуляторное сосудистое русло (МЦР) привлекает все бóльший интерес специалистов различных областей медицины и фармакологии, поскольку, вовлекаясь в различные патологические процессы и являясь «мишенью» для различных групп фармакологических препаратов, служит важнейшим источником информации о состоянии физиологических систем и всего организма в целом, что позволяет использовать ее параметры для диагностики [1][2]. Микрососудистая дисфункция может являться первым признаком развития заболевания и присутствовать до появления клинических признаков, а в ряде случаев нарушения микроциркуляции (МЦ) могут быть первопричиной заболеваний, определяя в дальнейшем их исход.

Кожная МЦ является перспективным диагностическим объектом для оценки периферического кровотока не только благодаря своей доступности для неинвазивного измерения, но и присутствия в ней практически всех механизмов регуляции (нейрогенных, гуморальных, местных), а также многообещающим прогностическим маркером при оценке действия лекарственных препаратов для лечения различных заболеваний [1][3]. Экспериментально подтверждена связь между дисфункцией кожных микрососудов и сосудистыми нарушениями различных органов и систем [4], в том числе при ишемической болезни сердца [5], сахарном диабете 1-го и 2-го типов [3][6], почечной недостаточности [7], гиперхолестеринемии, артериальной гипертензии и ожирении [8][9].

В настоящее время применяется ряд неинвазивных методов исследования, позволяющих оценить структурные и функциональные показатели МЦ: фотоплетизмография, инфракрасная спектроскопия, высокочастотная ультразвуковая допплерография, компьютерная капилляроскопия, лазерная спекл-визуализация, лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) и другие [1][10][11].

Метод ЛДФ-метрии считается «золотым стандартом» оценки функции микрососудов кожи, поскольку имеет неоспоримые преимущества по сравнению с другими методами: является неинвазивным; обеспечивает возможность длительных (5 и более минут) записей с высокой частотой дискретизации (обычно 32 Гц); позволяет оценивать кровоток в небольшом объеме (на фрагменте объемом 1 мм³), в который попадают терминальные и прекапиллярные артериолы, капилляры, посткапиллярные и собирательные венулы, артериоловенулярные анастомозы (АВА); его результаты коррелируют с фактической перфузией, измеренной методом видеокапилляроскопии; не так чувствителен к движению объекта; дает возможность получения большого количества параметров измерений; позволяет оценивать состояние функциональных механизмов управления микрокровотоком [12][13]. При этом применение флоуметрии в клинической и экспериментальной практике ограничено вследствие сложности интерпретации получаемых данных, а зачастую и невоспроизводимости результатов исследования. Следует отметить, что ЛДФ-граммы, регистрируемые у здоровых испытуемых [14–16] и пациентов с различными заболеваниями [17][18], могут существенно отличаться как в силу значительной пространственной и временной гетерогенности показателей кожной МЦ, так и индивидуально-типологических особенностей микрогемодинамики, а следовательно, влиять на правильную интерпретацию результатов исследования [1][14]. Отмечается, что истинное представление о нарушениях в МЦР, происходящих в результате развития заболевания, можно получить лишь при раздельном анализе показателей в группах пациентов с различными типами гемодинамики, поскольку изменения показателей могут иметь противоположную направленность [17].

Наиболее широко в популяции человека представлены нормоциркуляторный, гиперемический и гипоемический (спастический) типы, для каждого из которых характерен определенный диапазон значений анализируемых параметров ЛДФ-граммы. Кроме перечисленных существуют смешанные (с признаками нескольких типов) и переходные (пограничные) типы, а также различные варианты нарушения кровообращения, которые зависят от возраста, пола, образа жизни и заболевания [11][14].

Таким образом, не существует единого подхода к оценке типологических особенностей параметров периферического микрокровотока, полученных методом ЛДФ-метрии, что, безусловно, снижает практическое использование метода ЛДФ, но открывает перспективы для экспериментальных исследований на животных.

Исследования кожной МЦ животных проведены на свиньях [19], лошадях [20], морских свинках [21], кошках [22], мышах [23] и крысах [24–29], имеются лишь единичные работы, демонстрирующие особенности кожной МЦ крыс, которые зависят от пола и возраста [30]. В доступной литературе отсутствуют сведения о гемодинамических типах МЦ у лабораторных животных, в частности, у крыс, которые широко используются в экспериментальных исследованиях, направленных на оценку функционального состояния МЦР [24–29]. Такого рода данные необходимы прежде всего для оценки изменений кожной МЦ у животных при использовании различных экспериментальных моделей (ишемии, сахарного диабета и др.), воздействий химических и физических факторов и позволят в дальнейшем экстраполировать полученные результаты на человека, а следовательно, значительно расширить область применения метода ЛДФ для диагностики, что и обуславливает актуальность данного исследования.

Цель исследования — выявление и анализ типологических особенностей кожной микрогемодинамики крыс методом лазерной допплеровской флоуметрии.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Исследование выполнено в весенний период на 42 половозрелых крысах-самцах линии Wistar (федеральное государственное бюджетное учреждение «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова национального исследовательского центра «Курчатовский институт», питомник лабораторных животных «Рапполово» (Филиал НИЦ «Курчатовский институт» — ПИЯФ — ПЛЖ «Рапполово»)) среднего возраста (192,21 ± 11,73 дня) и среднего веса (377,57 ± 21,93 г), прошедших карантин (14 дней) и адаптированных к условиям эксперимента, взятию в руки (хэндлинг), проявляли признаки здорового состояния.

Размещение и содержание

Экспериментальная часть работы выполнена в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Экспериментальная физиология и биофизика» кафедры физиологии человека и животных и биофизики Института биохимических технологий, экологии и фармации федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» (ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского»).

Содержание животных и проведение экспериментов осуществлялось в соответствии с нормативными документами: приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199 н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33215–2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур», Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, «European Convention for the Protectionof Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123)», Strasbourg, 1986.

Лабораторные крысы содержались в условиях вивария с естественным свето-темновым циклом при температуре 18–22 °C, на подстиле на основе початков кукурузы (ООО «Зилубаг», Россия), со свободным доступом к воде и полноценному гранулированному корму ЛБК-120 (ЗАО «Тосненский комбикормовый завод», Россия). Все манипуляции с животными проводили согласно ГОСТ Р 53434–2009 от 02.12.2009, правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований, этическим стандартам, утвержденным правовыми актами Российской Федерации, принципам Базельской декларации и рекомендациям Комиссии по биоэтике ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского».

Дизайн исследования

Проведено выборочное экспериментальное исследование на 42 половозрелых крысах-самцах линии Wistar. У всех животных, включенных в исследование, проводили регистрацию показателей кожной МЦ методом ЛДФ. Блок-схема дизайна исследования представлена на рисунке 1.

Объем выборки

В эксперименте использовались животные (n = 42) одного пола (самцы), средних возраста (192,21 ± 11,73 дня) и веса (377,57 ± 21,93 г). На этапе включения животных в эксперимент выделение групп не предусмотрено.

Критерии соответствия

Критерии включения

В исследование включались половозрелые самцы крыс линии Wistar без внешних признаков заболеваний, в том числе кожных, физических дефектов и травм.

Критерии невключения

В эксперимент не включались животные, вес которых был меньше 350 и больше 400 г, с определяемыми визуально признаками заболеваний или физическими дефектами, самки.

Критерии исключения

Гибель животного, осложнения после проведения манипуляций.

Рандомизация

Не требовалась. В соответствии с критериями включения и исключения в эксперимент отобрано 42 крысы.

Обеспечение анонимности данных

Оценка результатов исследования и анализ полученных данных проводились авторами без введения дополнительных лиц.

Итоговые показатели (исходы исследования)

Итоговые показатели исследования — амплитуды колебаний скорости кровотока в эндотелиальном, нейрогенном, миогенном, дыхательном и сердечном частотных диапазонах; вклад амплитуд выделенных ритмов в сумму амплитуд различных частот спектра; отношение притока крови к венозному оттоку; индекс эффективности микроциркуляции. Исходы исследования — оценка различий трех типов ЛДФ-грамм экспериментальных животных с помощью вейвлет-анализа микроциркуляторных сигналов допплерографии и выделение типов кожной микрогемодинамики: нормо-, гипо- и гиперемический.

Экспериментальные процедуры

У всех экспериментальных животных определяли показатели кожной МЦ методом ЛДФ с помощью лазерного анализатора кровотока «ЛАЗМА-МЦ-1» (производство НПП «Лазма», Россия; регистрационное свидетельство на медицинское изделие № РЗН 2015/3142 от 28.10.2015; декларация соответствия № POСС RU Д-RU ИМ18.В 00079/18 от 27.12.2018 г.) с источником лазерного излучения (длина волны 0,8 мкм) и программным обеспечением LDF 2.20.0.507WL (производство НПП «Лазма», Россия). Зондирующее лазерное излучение позволяет обнаруживать отраженный сигнал из слоя ткани около 1 мм. Излучение, отраженное от статических элементов ткани, не меняет свою частоту, а излучение, которое отражается от движущихся эритроцитов, характеризуется допплеровским смещением частоты к зондирующему сигналу, что позволяет определить скорость движения эритроцитов в исследуемом объеме ткани [1][14].

Для исключения движений исследуемого животного во время флоуметрии оно помещалось в пенал (АЕ1001-R0, НПК «Открытая Наука», Россия), размер которого подбирали так, чтобы животное могло свободно дышать и ни одна часть тела не была плотно зажата. Показатели МЦ снимали с основания хвоста, лишенного плотного волосяного покрова, который фиксировали на ровной поверхности на одной линии с телом в горизонтальном положении тканевым пластырем. Оптоволоконный зонд прибора «Лазма-МЦ-1» крепили у основания хвоста крысы перпендикулярно с помощью тканевого пластыря (рис. 2).

Сигнал записывали в тот момент, когда животное находилось в спокойном состоянии, и регистрировали показатели, характеризующие уровень базального кровотока [14].

Показатель микроциркуляции (ПМ; уровень перфузии; Laser Doppler Perfusion, перф. ед.) — характеризует общую (капиллярную и внекапиллярную) среднюю перфузию крови в микрососудах в единице объема ткани за время исследования (формула 1):

ПМ = N_эр × V_ср, (1)

где: N_эр — среднее количество эритроцитов в зондируемой области (концентрация эритроцитов); V_ср — средняя скорость эритроцитов в зондируемой области.

Концентрация эритроцитов, или тканевой гематокрит, (Nэр) зависит от содержания эритроцитов в капиллярной крови (Нкп, %) и количества одновременно функционирующих капилляров (Nк) в зондируемом объеме, которое, в свою очередь, определяется особенностями микрокровотока в ткани, работой прекапиллярных сфинктеров и артериовенуллярных анастомозов (АВА), величиной пре- и посткапиллярного сопротивления, реологическими параметрами крови (формула 2):

Nэр = Нкп × Nк,(2)

где Нкп — содержание эритроцитов в капиллярной крови в исследуемом объеме; Nк — количество функционирующих капилляров во время записи.

ПМ имеет непостоянный характер, поэтому большое диагностическое значение имеют показатели, характеризующие его изменчивость (флакс и коэффициент вариации).

СКО (σ, перф. ед.) — среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения ПМ, именуемое в микрососудистой семантике «флакс» («flux»), характеризует временную изменчивость перфузии, отражает среднюю модуляцию кровотока во всех частотных диапазонах.

Коэффициент вариации (Kв %) — отношение флакса к среднему значению перфузии в зондируемом участке ткани (формула (3)):

Kв = (СКО/ПМ)×100 %, (3)

где ПМ — среднее арифметическое значение показателя микроциркуляции (перфузии); СКО — среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения ПМ.

Для того чтобы получить представление о механизмах регуляции МЦ кожи, проводили вейвлет-анализ (интегральное преобразование, позволяющее перевести сигнал из временно-амплитудного во временно-амплитудно-частотное представление [31]) микроциркуляторных сигналов ЛДФ.

В ЛДФ-граммах человека выделяют до восьми не перекрывающихся частотных диапазонов колебаний кровотока, из которых пять особо значимы для диагностики микроциркуляторных расстройств [1][13][32]. У крыс эти частотные диапазоны имеют определенные отличия: эндотелиальные (0,010–0,076 Гц [26]; ~0,010 Гц [25]), нейрогенные (0,076–0,200 Гц [24]; ~0,050 [25]), миогенные (0,200–0,740 Гц [24]; ~0,100 [25]), дыхательные (0,740–2,000 Гц [26]; ~1,000 [25]) и сердечные (пульсовые) (2,000–5,000 Гц [24]).

Вейвлет-анализ позволяет получить целый комплекс показателей, которые в совокупности дают представление о колебательных процессах в микрососудах. Ввиду вариабельности значений амплитуд (А, перф. ед.) колебаний анализируемых ритмов используются их нормированные величины (Анорм, перф. ед.), что дает возможность исключить влияние посторонних факторов на проведение исследований и сравнивать величины амплитуд у разных животных (формула (4)):

А_норм = А/3 СКО, (4)

где А — амплитуда колебаний скорости кровотока анализируемого ритма; СКО — среднеквадратическое отклонение амплитуды скорости кровотока от среднего арифметического значения.

Использование программы LDF 2.20.0.507WL дает возможность автоматически рассчитывать нормированные амплитуды колебаний скорости кровотока для каждого диапазона частот.

Значения нейрогенного (НТ), миогенного (МТ) и эндотелий-зависимого (ЭЗКТ) компонентов тонуса микрососудов (перф. ед.) кожи крыс определяли по формулам (формула (5)):

НТ = СКО/Амакс. н., (5)

где НТ — нейрогенный тонус прекапиллярных резистивных микрососудов; СКО — среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения ПМ; Амакс. н. — максимальное значение амплитуды колебаний скорости кровотока в нейрогенном диапазоне.

МТ= СКО/Амакс. м., (6)

где МТ — миогенный тонус метартериол и прекапиллярных сфинктеров (формула (6)); среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения ПМ; Амакс. м. — максимальное значение амплитуды колебаний скорости кровотока в миогенном диапазоне.

ЭЗКТ = СКО/Амакс. э., (7)

где ЭЗКТ — эндотелий-зависимый компонент тонуса артериол (формула (7)); СКО — среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения ПМ; Амакс. э. — максимальное значение амплитуды колебаний скорости кровотока в эндотелиальном диапазоне.

Индекс эффективности микроциркуляции (ИЭМ) рассчитывали как отношение суммы амплитуд колебаний скорости кровотока эндотелиального, миогенного и нейрогенного ритмов к сумме амплитуд колебаний скорости кровотока пульсового и дыхательного ритмов по формуле (8):

ИЭМ = (Аэ + Ан + Ам)/(Ад + Ас), (8)

где Аэ — амплитуда колебаний скорости кровотока эндотелиального, Ан — неройгенного, Ам — миогенного, Ад — дыхательного, Ас — сердечного ритмов.

Сумму (ΣА) амплитуд колебаний скорости кровотока в эндотелиальном, нейрогенном, миогенном и сердечном частотных диапазонах, которая указывает на совокупность механизмов, обеспечивающих приток крови в микроциркуляторное русло, рассчитывали по формуле (9):

ΣА = Аэ + Ан + Ам + Ас, (9)

где Аэ — амплитуда колебаний скорости кровотока в эндотелиальном диапазоне, Ан — амплитуда колебаний скорости кровотока в нейрогенном диапазоне, Ам — амплитуда колебаний скорости кровотока в миогенном диапазоне, Ас — амплитуда колебаний скорости кровотока в пульсовом диапазоне.

Отношение притока крови к венозному оттоку (С) рассчитывали по формуле (10):

С = ΣА/Ад, (10)

где Ад — амплитуда колебаний скорости кровотока в дыхательном диапазоне.

Имеются определенные отличия в регуляции микрокровотока по нутритивным сосудам и атриовентрикулярным анастомозам (АВА). ЛДФ-метрия позволяет оценивать отношение шунтового к нутритивному кровотоку. Показатель шунтирования (ПШ), указывающий на относительную долю шунтового кровотока в общем объеме кровотока, вычисляли по формуле (11):

ПШ = Ан/Ам, (11)

где Ан — амплитуда колебаний скорости кровотока в нейрогенном диапазоне, Ам — амплитуда колебаний скорости кровотока в миогенном диапазоне.

Нутритивный кровоток (Мнутр.; скорость кровотока в нутритивных микрососудах) рассчитывали по формуле (12):

Мнутр. = ПМ/ПШ, (12)

где ПМ — среднее значение перфузии, ПШ — показатель шунтирования.

Для диагностики состояния кровотока по шунтовым и нутритивным путям рассчитывали величину нутритивной перфузии (ПМнутр., перф. ед.; средняя перфузия крови в нутритивных микрососудах в единице объема ткани за время исследования) по формуле (13):

ПМнутр. = ПМ/(1 + ПШ), (13)

где ПМ — среднее значение перфузии; ПШ — показатель шунтирования.

Величину шунтовой перфузии (ПМшунт., перф. ед; средняя перфузия крови по АВА в единице объема ткани за время исследования) оценивали по формуле (14):

ПМшунт. = ПМ — Мнутр., (14)

где ПМ — среднее значение перфузии; Мнутр. — нутритивный кровоток.

Уход за животными и мониторинг

Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре +18–22 °C на подстиле «Рехофикс МК 2000» («Й. Реттенмайер унд Зене ГмбХ + КоКГ», Германия) с естественным свето-темновым циклом, свободным доступом к воде и полноценному гранулированному корму. Выведение животных из эксперимента не проводилось.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Предварительный расчет выборки не производился.

Статистические методы

Статистическую обработку и графическое представление экспериментальных данных проводили с использованием программ Statistica версия 12 (Statsoft, США), Graph Pad Prism 10.0 (Boston, Massachusetts USA) и Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, США). Проверку распределения данных на нормальность осуществляли с помощью критерия Шапиро — Уилка. Поскольку распределение данных в подавляющем большинстве случаев не соответствовало нормальному, значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Краскела — Уоллиса. Множественные апостериорные сравнения (post-hoc comparisons) значений показателей между группами проводили с помощью критерия Данна (Bonferroni-Dunn post hoc test, Dunn’s multiple comparison post-test). Для описания результатов исследования в качестве меры центральной тенденции указывали медианы, а в качестве меры разброса — значения нижнего и верхнего квартилей показателей для каждой из сравниваемых групп. Данные представлены в виде таблиц и гистограмм. В таблице, на рисунках и в тексте значения показателей для соответствующей группы крыс представлены в виде медианы и нижнего и верхнего квартилей (0,25; 0,75). В описании сравнения значений показателей в разных группах животных использовались %, которые рассчитывались по значениям медианы показателей соответствующих групп. Различия между значениями показателей считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Фундаментальной особенностью МЦР является его постоянная изменчивость. Как показали результаты настоящего исследования, в нативных записях ЛДФ-грамм крыс выявлена значительная вариабельность регистрируемых показателей, которые проявлялась прежде всего в колебаниях уровня перфузии относительно среднего значения за определенный промежуток времени исследований (рис. 3). Колебания перфузии представляют собой некую случайную функцию, в которой присутствует ряд гармонических составляющих, зависящих как от изменения во времени внутренних диаметров микрососудов, так и от скорости потока эритроцитов в них. Временную изменчивость уровня перфузии характеризуют СКО и Кв.

В настоящем исследовании у разных крыс СКО изменялся от 1,59 до 7,68 перф. ед., а Кв имел значения от 19,79 до 61,40 % (табл. 1). Увеличение СКО и Кв свидетельствует о более глубокой модуляции микрокровотока во всех частотных диапазонах в результате активации механизмов регуляции при практически не изменяющейся величине ПМ и отражает улучшение состояния кожной МЦ [11][14][32].

Следовательно, у экспериментальных животных выявлены разные типы колебательных процессов тканевого кровотока, которые обусловлены высокими и низкими значениями СКО и Кв, что позволило нам выделить два типа ЛДФ-грамм с различным характером колебаний (рис. 3 и табл. 1).

Первый тип (апериодический), к которому относился 41 % животных от их общего количества в эксперименте (табл. 1), характеризовался четко выраженными высокоамплитудными апериодическими колебаниями уровня перфузии: СКО 4,86 (4,55; 5,39) перф. ед. и Кв 47,38 % (42,04; 51,22) в этой группе крыс были максимальными. Для апериодического типа ЛДФ-грамм характерен и сравнительно высокий уровень ПМ 10,76 (8,61; 12,51) перф. ед. (табл. 1), отражающий усредненную величину перфузии в капиллярах, артериолах и венулах, что свидетельствует о высокой степени кровенаполнения МЦР у животных этой группы.

Для большинства крыс (59 % от общего количества) был характерен монотонный вариант колебаний ПМ с низкими значениями СКО и Kв (табл. 1). Однако в этой группе крыс наблюдался большой разброс данных по величине ПМ: от 6,59 до 19,94 перф. ед., что позволило разделить этих животных на две группы: монотонный тип с низкой перфузией (8,87 (7,83; 10,25) перф. ед.), который регистрировался у 33 % экспериментальных животных, и с высокой перфузией (13,86 (12,18; 14,38) перф. ед.), к которому принадлежит 26 % крыс (табл. 1). Следует отметить, что ПМ у крыс с монотонным типом и низкой перфузией оказался на 17,57 % (р = 0,048) и 36,00 % (р < 0,001) ниже, чем у животных с апериодическим и монотонным с высокой перфузией типами соответственно (табл. 1), что свидетельствует о низкой степени кровенаполнения микроциркуляторного русла у животных этой группы.

Таким образом, основными критериями деления животных на группы являлись: тип колебательных процессов тканевого кровотока, который обусловлен высокими и низкими значениями СКО и Кв; величина ПМ, характеризующая уровень перфузии ткани. Однако данные показатели базального кровотока дают лишь общую оценку состояния тканевой МЦ, а более детальную картину функционирования МЦР можно получить путем анализа амплитудно-частотного спектра (АЧС) колебаний скорости кровотока, который отражает функциональное состояние основных регуляторных факторов [13][32].

На данный момент спектральный вейвлет-анализ микроциркуляторных сигналов ЛДФ, проведенный у здоровых людей и некоторых видов животных, выявил пять характерных частотных интервалов в диапазоне от 0,005 до 2,000 Гц, которые условно делят на «активные» и «пассивные» [32].

К «активным» (тонусформирующим) относят факторы, которые регулируют поток крови со стороны сосудистой стенки через ее мышечную составляющую путем изменения сопротивления потоку крови и создают поперечные колебания кровотока. Внутрисосудистая вазомоторная регуляция возможна только в микрососудах, в которых есть гладкомышечные клетки, т. е. в прекапиллярных артериолах. К тонусформирующим относят эндотелиальные, нейрогенные и миогенные ритмы.

Эндотелиальные являются наиболее «медленными» ритмами в АЧС ЛДФ-граммы (от 0,005 до 0,021 Гц). Этот частотный интервал принято разделять на два диапазона: эндотелиальный NO-независимый и эндотелиальный NO-зависимый (около 0,01 Гц у крыс [25]), обусловленный периодическими изменениями концентрации оксида азота (NO) [33][34].

Амплитуда эндотелиальных NO-зависимых колебаний кожной МЦ у крыс с апериодическим типом ЛДФ-грамм (1 группа) составила 5,07 (4,22; 6,17) перф. ед., однако у животных с монотонными типами имелись статистически значимые отличия: у крыс с низкой перфузией (2 группа) Аэ была ниже на 32 % (р = 0,043), а с высокой (3 группа) — выше на 49 % (р = 0,027) по сравнению со значениями этого показателя у крыс с апериодическим типом МЦ. Следует отметить и статистически значимые различия в значениях Аэ у крыс с монотонными типами: у животных с высокой перфузией Аэ выше на 121 % (р < 0,001), чем у крыс с низкой перфузией (рис. 4).

Повышенные Аэ свидетельствуют об увеличении секреции в кровь NO, модуляции мышечного тонуса сосудов в сторону его снижения. Эндотелий-зависимый компонент тонуса артериол у крыс с монотонным типом и высокой перфузией был существенно ниже, чем у животных апериодического (на 33 %; р = 0,026) и монотонного с низкой перфузией (на 56 %; р < 0,001) типов (рис. 5), что способствует вазодилатации артериол и увеличению притока крови в капилляры. Напротив, у крыс с низкой перфузией ЭЗКТ на 50 % (р = 0,042) превышал таковой у крыс апериодического типа (рис. 5), что свидетельствует о снижении скорости кровотока в микрососудах.

Эндотелий-зависимая вазодилатация артериол связана с синтезом оксида азота (NO) c помощью NO-синтазы, интенсивность которого зависит от химических и физических (сдвиговое напряжение) воздействий [35]; секреторной активности эндотелия венул [36]; активных форм кислорода, снижающих продукцию NO эндотелиальной NO-синтазой [37]; CGRP (calcitonin gene-related peptide), связанного с геном кальцитонина, стимулирующим синтез NO [38]. NO действует на гладкомышечные клетки мелких артерий и крупных артериол на входе в микрососудистое русло [39], регулирует тонус сосудов, вызывая вазодилатацию и снижение кровяного давления.

Эндотелий контролирует тонус микрососудов и вазомоторную активность миоцитов интравазально через миоэндотелиальные контакты, а экстравазальный механизм регуляции на прекапиллярном (артериолярном) уровне осуществляется через гладкомышечные клетки путем нейрогенной регуляции.

Колебания скорости кровотока в микрососудах в диапазоне частот 0,02–0,05 Гц у человека [13], а у крыс вблизи 0,05 Гц [25] относятся к нейрогенным.

Ан у крыс с апериодическим типом ЛДФ-грамм (1 группа) составляла 4,89 (4,03; 6,00), у животных с монотонными типами МЦ выявлены статистически значимые отличия значений этого показателя от такового у крыс первой группы: более низкие Ан (на 23 %; р = 0,047) на фоне высокого НТ (на 33 %; р = 0,046) у крыс с низкой перфузией (2 группа) и, наоборот, более высокие Ан (на 42 %; р = 0,046) на фоне снижения НТ (на 17 %; р = 0,045) у крыс с высокой перфузией (3 группа) (рис. 4, 5). Значения Ан и НТ имели также существенное отличие у животных монотонных типов ЛДФ-грамм: у крыс с высокой перфузией Ан выше на 85 % (р < 0,001), а НТ ниже на 38 % (р < 0,001), чем у крыс с низкой перфузией (рис. 4, 5).

Колебания в нейрогенном диапазоне частот связаны с симпатической активностью адренергических нервных волокон, иннервирующих гладкомышечные клетки стенки артериол [13]. Следовательно, более высокие значения Ан и низкие значения НТ у крыс монотонного типа с высокой перфузией свидетельствуют о снижении симпатической активности адренергических нервных волокон и уменьшении тонуса прекапиллярных резистивных микрососудов, и, наоборот, сниженная Ан и более высокий НТ у крыс монотонного типа с низкой перфузией — об усилении симпатической активности адренергических нервных волокон и повышении тонуса прекапилляров.

Существенное значение для оценки тонуса прекапилляров имеют миогенные колебания кровотока (диапазон 0,06–0,15 Гц) [40], регистрируемые у крыс в диапазоне ~0,1 Гц [25], происхождение которых связано с локальными пейсмекерами гладкомышечных волокон сосудистой стенки.

У животных выделенных групп наблюдались определенные отличия значений Ам (собственно вазомоций). Так, у крыс монотонных типов с низкой перфузией Ам была ниже на 8,15 % (р = 0,999), а с высокой перфузией — статистически значимо выше на 71,45 % (р < 0,001) по сравнению со значением этого показателя у животных первой группы (рис. 4). У животных третьей группы миогенный компонент регуляции тонуса (МТ) оказался значимо ниже на 43 %, чем у крыс первой (p = 0,001) и второй (р < 0,001) групп (рис. 5).

Миогенные колебания скорости кровотока регистрируются прежде всего в метартериолах и прекапиллярных сфинктерах, в которых отсутствует симпатическая иннервация (вазомоции осуществляются как при сохранной иннервации, так и в условиях ее отсутствия), т. е. непосредственно перед капиллярным руслом, однако проводятся и в капиллярное русло кожи [40]. Установлена положительная корреляция числа функционирующих капилляров (метод компьютерной капилляроскопии) с нормированными амплитудами осцилляций миогенного диапазона (ЛДФ-метрия), которая отсутствует с амплитудами нейрогенных и эндотелиальных NO-зависимых ритмов [12].

Следовательно, высокие значения Ам и низкий МТ в ЛДФ-грамме крыс с монотонным типом и высокой перфузией (3-я группа) свидетельствуют о снижении миогенного компонента периферического сопротивления, дилатации гладкомышечных прекапилляров и прекапиллярных сфинктеров, увеличении числа функционирующих капилляров и притока крови в нутритивное русло.

В модуляции потока крови в сосудах МЦР, наряду с внутрисосудистыми механизмами, которые инициируются непосредственно в микрососудах и отражают изменения тонусформирующих механизмов, большое значение имеют и внесосудистые компоненты регуляции: сердечная волна, приходящая в микрососуды со стороны терминальных артерий (сердечный ритм на «входе» в МЦР), и дыхательная волна (присасывающее действие «дыхательного насоса»), поступающая в МЦР со стороны вен. Поскольку эти колебания формируются вне сосудов МЦ и забрасываются в них с потоком крови, то их называют «пассивными», они направлены вдоль потока крови.

Межгрупповые различия наблюдались у животных и при сравнении амплитуд колебаний сердечного и дыхательного ритмов.

Сердечные (Ас, пульсовые, кардиоритмы) колебания регистрируются у человека в частотном диапазоне 0,6–2,0 Гц [13][32] и 2,0–5,0 Гц у крыс [24] в мелких артериях и крупных артериолах на входе в МЦР.

Амплитуда сердечной волны, отражающая перфузионное давление в микрососудах, имела определенные различия у крыс выделенных групп (рис. 4). У крыс с апериодическим типом Ас составила 5,03 (4,09; 5,57) перф. ед., у крыс с монотонным типом и низкой перфузией 4,89 (3,61; 5,52) перф. ед. и статистически значимо не отличалась от значений этого показателя у крыс с апериодическим типом (р = 0,999). Однако у крыс с монотонным типом и высокой перфузией Ас была достоверно выше на 45,53 % (р = 0,021), чем у животных первой группы, и на 49,69 % (р = 0,007), чем у животных второй группы.

Колебания скорости кровотока, синхронизированные с дыханием, поступают в сосуды МЦР со стороны путей оттока крови и регистрируются в венулах в частотном диапазоне 0,15–0,60 Гц у человека [13][24][32][41] и 0,740–2,000 Гц [24]; ~1,000 [25] у крыс. Ад составила 3,33 (2,71; 3,64) перф. ед. у крыс с апериодическим типом и 4,50 (3,61; 4,94) перф. ед. у крыс с монотонным типом и низкой перфузией, а у крыс с монотонным типом и высокой перфузией была значимо выше на 116,82 % (р < 0,001), чем у животных первой, и на 60,44 % (р = 0,007), чем у животных второй группы (рис. 4).

Обсуждаются разные гипотезы происхождения дыхательных волн: механическая пассивная трансмиссия респираторных изменений внутригрудного давления, влияющая на венозный возврат к сердцу и, следовательно, на артериальное давление, и центральное вегетативное взаимодействие дыхательного и сосудодвигательного центров [1][13][41]. Дыхательная волна связана с дыхательной модуляцией кровотока в венозных отделах МЦР, а увеличение ее амплитуды указывает на уменьшение венозного оттока [13][32], что, по-видимому, характерно для крыс с монотонным типом и высокой перфузией.

Таким образом, в результате анализа АЧС ЛДФ-грамм у крыс выделенных групп выявлены определенные отличия функционального состояния основных регуляторных факторов кожной МЦ, включающих в себя эндотелиальные, нейрогенные, миогенные и метаболические механизмы, что в результате влияет на транскапиллярный обмен.

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация/научная значимость

На основании анализа показателей базального кровотока у крыс выделено три типа ЛДФ-грамм: апериодический, монотонный с низкой и монотонный с высокой перфузией (табл. 1).

Для апериодического типа ЛДФ-грамм характерны высокие значения флакса, коэффициента вариации и достаточно высокий уровень ПМ. При анализе АЧС ЛДФ-грамм у крыс данной группы установлен сдвиг спектральных характеристик в сторону внутрисосудистых компонентов регуляции МЦ. Особенности амплитудно-частотных характеристик ЛДФ-грамм у крыс с апериодическим типом ЛДФ-граммы свидетельствуют об оптимальном функционировании тонусформирующих механизмов регуляции МЦ, что связано с NO-зависимой активностью эндотелия, ограничением вазоконстрикторного контроля артериолярного тонуса симпатическими нервами, невысоким тонусом прекапиллярных метартериол и, как следствие, — развитии мышечной релаксации, что в сочетании с высокоамплитудным сердечным и низкоамплитудным дыхательным ритмами и их вкладом в общую мощность спектра свидетельствует об увеличении притока крови в МЦР на фоне усиления венулярного оттока [1][13][32]. Указанные особенности способствуют оптимальному микрокровотоку за счет нутритивного и ненутритивного (шунтового) путей (рис. 6).

Таким образом, данные, полученные при анализе ЛДФ-грамм, а также высокий относительно других групп крыс ИЭМ (1,89 (1,32; 2,18); рис. 7), показывающий соотношение модуляций кожного кровотока, обусловленных тонусформирующими «активными» (эндотелиальным, миогенным, нейрогенным) механизмами, и внесосудистыми «пассивными» (сердечная и дыхательная волны) факторами, демонстрируют сбалансированность регуляторных процессов МЦ у животных первой группы и позволяют отнести данный тип ЛДФ-грамм, согласно классификации [14], к нормоемическому (нормоциркуляторному) типу микрогемодинамики.

Для второго типа ЛДФ-грамм (монотонный с низкой перфузией) характерны более низкие значения показателей базального кровотока (СКО, Kв и ПМ) по сравнению с апериодическим типом (табл. 1). Анализ АЧС ЛДФ-грамм крыс этой группы выявил существенно более низкие значения амплитуд ритмов внутрисосудистых компонентов регуляции тканевого кровотока (эндотелиального и нейрогенного; рис. 4) на фоне более высоких эндотелий-зависимого и нейрогенного компонентов сосудистого тонуса по сравнению со значениями этих показателей у животных с первым типом ЛДФ-грамм (рис. 5), что, согласно данным литературы [1][13][32][39][40], позволяет предположить снижение секреции NO эндотелием микрососудов, повышение симпатической адренергической активности, а следовательно, увеличение тонуса прекапиллярных резистивных микрососудов, увеличение внутрисосудистого сопротивления, что приводит к ограничению притока крови в нутритивное русло. Однако у животных этой группы амплитуда сердечной волны оставалась относительно высокой и статистически значимо не отличалась от таковой у крыс первой группы (рис. 4), что вызвало лишь тенденцию к снижению притока крови в МЦР (на 17 %; р = 0,053) относительно значений этого показателя у крыс с первым типом МЦ на фоне значимого уменьшения отношения притока крови в микрососуды к венозному оттоку (на 42 %; p = 0,001) по сравнению с животными апериодического типа (рис. 8), результатом чего, по-видимому, и является низкий уровень перфузии у животных этой группы (табл. 1).

Снижение роли «активных» вазомоторных механизмов в регуляции МЦ, смещение амплитудно-частотной доминанты в высокочастотную область АЧС у животных этой группы привело к статистически значимому снижению ИЭМ на 36 % (p = 0,021) по сравнению с крысами апериодического типа (рис. 7). Выявленные особенности ЛДФ-метрии у животных второй группы позволяют охарактеризовать данный тип микрогемодинамики, согласно классификации [14], как гипоемический.

Для монотонного типа ЛДФ-грамм с высокой перфузией, в отличие от двух предыдущих, характерны достоверно более высокие значения ПМ на фоне низких значений Кв и СКО (табл. 1), что отражается в монотонном характере ЛДФ-граммы. Особенностями АЧС ЛДФ-грамм животных этой группы являются достоверно более высокие значения амплитуд тонусформирующих компонентов спектра на фоне снижения всех компонентов тонуса прекапиллярных микрососудов по сравнению с таковыми у животных двух других типов (рис. 4, 5), что свидетельствует о значительном увеличении активности эндотелия в отношении секреции в кровь NO, об уменьшении нейрогенного контроля артериолярного тонуса, снижении миогенного компонента периферического сопротивления, а следовательно, о развитии мышечной релаксации, дилатации гладкомышечных прекапилляров и прекапиллярных сфинктеров, увеличении числа функционирующих капилляров и их диаметра [1][13][32][39][40]. Наряду с этим у крыс с данным типом ЛДФ-граммы наблюдался значительный рост амплитуды сердечного ритма, которая попадает в МЦР со стороны артерий (рис. 4). Увеличение амплитуды ритма в этом частотном диапазоне, вероятно, отражает увеличение частоты сердечных сокращений, компенсирующее падение периферического сопротивления, вызванное нейрогенноопосредованной кожной вазодилатацией [9]. Поскольку величина Ас пропорциональна количеству артериальной крови, поступающей в МЦР, и косвенно указывает на тонус крупных артериол [32], то увеличение Ас на фоне высоких значений ПМ отражает увеличение притока крови в МЦР: на 59 % (p = 0,004) больше по сравнению с крысами первой и на 68 % (p < 0,001) больше по сравнению с крысами второй группы (рис. 8). Об этом свидетельствует и увеличение величины нутритивной перфузии по сравнению со значением данного показателя у крыс первой группы на 30 % (p = 0,004), а по сравнению со значением данного показателя у крыс второй группы — на 49 % (p < 0,001) (рис. 6).

В АЧС крыс этой группы наблюдали и самые высокие значения амплитуды дыхательной волны (рис. 4), что свидетельствует об ухудшении венозного оттока и проявляется в снижении на 41 % (p = 0,003) отношения притока крови к венозному оттоку по сравнению с крысами апериодического типа (рис. 8). Увеличение Ад на фоне высокого ПМ указывает на застойные явления в венулярном звене МЦР [1][32] и дает основание предполагать у крыс этой группы наличие венозного полнокровия. Увеличение притока крови со стороны артериол и ухудшение оттока крови со стороны венул могут привести к гиперемии тканей, а следовательно, влияют на соотношение нутритивного и шунтового ненутритивного кровотока по АВА, которые обеспечивают поток крови в обход капиллярного русла [1].

Ведущим в регуляции кровотока по АВА является нейросинаптический адренергический механизм [32]. Поэтому регистрируемые у крыс третьей группы высокие значения ПМ, наряду с высокими значениями амплитуд нейрогенных колебаний, свидетельствуют об усилении шунтового кровотока, на что указывает и величина шунтовой перфузии, которая была выше на 13 % (p = 0,441) и 48 % (p < 0,001) значений этого показателя у крыс первой и второй групп соответственно (рис. 6). Можно предположить, что усиление шунтового ненутритивного кровотока у крыс с высокой перфузией является следствием артериальной гиперемии и способствует избавлению капилляров от избытка крови, а МЦР — от застойных явлений. Совокупность описанных особенностей позволяет отнести данный тип ЛДФ-грамм к гиперемическому типу микрогемодинамики.

Ограничения исследования

Ограничений не было.

Обобщаемость/экстраполяция

ЛДФ-метрия открывает большие диагностические возможности для исследования микрогемодинамики у человека и животных. Безусловно, при ЛДФ-метрии нарушений МЦ или ее изменении при различных воздействиях, в том числе применении фармакологических средств, основное значение имеет анализ не только базальных показателей МЦ, а в большей степени — состояния колебательных процессов, связанных с механизмами регуляции тканевого микрокровотока. Поэтому целесообразна не изолированная оценка одного или нескольких параметров ЛДФ-граммы, а анализ целого комплекса показателей, предоставляющий информацию о регуляторных механизмах вазомоторной активности микрососудов.

Диагностическое значение различных показателей микроциркуляторного кровотока, зарегистрированных методом ЛДФ с помощью анализа АЧС отраженного сигнала с использованием математического аппарата вейвлет-преобразования, а также полученных расчетным путем, подробно изложено в данной статье, в монографиях, обзорах и экспериментальных работах [1][11–14][32][34][40]. Однако, как уже было отмечено, ЛДФ-граммы, регистрируемые у пациентов с одинаковыми патологиями, могут существенно отличаться [17][18], что может быть связано с рядом факторов, в том числе и с различным исходным состоянием функционирования МЦР, которое чаще всего не учитывается, но влияет на правильную интерпретацию результатов исследования и их воспроизводимость. Поэтому нам представляется перспективным разделение ЛДФ-грамм у человека и животных на три типа микрогемодинамики: нормо-, гипо- и гиперемический. Физиологические различия между ними заключаются, в первую очередь, в исходном уровне перфузии (ПМ), СКО и Кв. Как продемонстрировали экспериментальные исследования, исходно высокие значения ПМ могут быть связаны со снижением микрососудистого тонуса, увеличением объема крови в артериолах и явлениями застоя крови в венулярном звене МЦР, что характерно для гиперемического типа МЦ. Напротив, исходно низкие значения ПМ, связанные с уменьшением концентрации эритроцитов в исследуемом объеме ткани, связаны с уменьшением лабильности сосудистой стенки, повышением ее жесткости и увеличением тонуса метартериол и прекапиллярных сфинктеров, снижением притока крови в микрососуды, что характерно для гипоемического типа МЦ.

Чем выше временная изменчивость перфузии (апериодичность), характеризующаяся высокими значениями СКО (флакса) и Кв, тем более интенсивно функционируют регуляторные механизмы МЦ при средних величинах ПМ, что и было зарегистрировано у животных, отнесенных к нормоемическому (нормоциркуляторному) гемодинамическому типу. Снижение величин СКО и Кв (монотонная ЛДФ-грамма) свидетельствует об уменьшении активности механизмов регуляции тканевого кровотока, изменении соотношения внутри- и внесосудистых компонентов регуляции сосудистого тонуса, а, следовательно, гипо- или гиперемии микрососудов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты, направленные на учет в диагностике типологических особенностей функционирования МЦР у человека и животных, позволяют не только выявить специфику индивидуальных особенностей организма, но и разработать критерии для проведения ЛДФ-метрии в условиях патологии с целью объективной оценки отклика тканевого кровотока на воздействие факторов разной природы и интенсивности, а также эффективности проводимого лечения, а следовательно, открывают перспективы дальнейших исследований.