Эффективность нового производного 3-гидроксипиридина в коррекции процессов свободнорадикального окисления при посттравматическом артрите: экспериментальное доклиническое рандомизированное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Посттравматический остеоартрит (ПТОА) составляет более 12% всех случаев диагностирования остеоартритов. Однако, хотя обычно остеоартрит относят к возраст-ассоциированным заболеваниям, этот вариант встречается преимущественно у лиц молодого возраста, в особенности у спортсменов [1], и характеризуется высокой распространенностью не только в России, но и в других странах. Согласно эпидемиологическим данным в США данной патологией страдают около 5,6 млн человек [2]. Риск развития ПТОА увеличивается с возрастом пациента на момент получения травмы и со временем после получения травмы [1][3]. Наличие дополнительных факторов риска развития ПТОА, таких как ожирение или генетические факторы риска, может приводить к более тяжелым последствиям [1][4].

Травма сустава в той или иной степени оказывает влияние на все ткани сустава, однако повреждение суставного хряща является наиболее значимым, поскольку оно в значительной степени необратимо и может стать основным фактором, определяющим последующее развитие остеоартрита [5][6]. Существует определенная степень необратимого повреждения, но в первые дни или недели с момента получения травматического повреждения патологические изменения прогрессируют наиболее быстро [7][8]. Острые симптомы после травмы сустава включают боль и отек из-за внутрисуставного кровотечения, выпота в синовиальную сумку и инфильтрацию суставных тканей воспалительными клетками [9][10].

Несмотря на усовершенствование методических рекомендаций по лечению ПТОА, заболевание имеет тенденцию к прогрессированию с усилением болевого синдрома и снижением качества жизни пациентов, что связано с многогранностью механизмов повреждения и особенностями проявления факторов защиты местного и системного характера [11][12]. Немаловажно, что существенную роль в прогрессировании посттравматического воспаления в суставе играют перекисное окисление липидов (ПОЛ) и активация протеолитических ферментов — матриксных металлопротеиназ [13][14]. В результате возникшей травмы происходит повреждение клеточных структур, изменение цитологического состава синовиальной жидкости с нарушением трофики тканей сустава. Поврежденные клеточные элементы лизируются макрофагами и нейтрофилами, которые через механизм респираторного взрыва образуют активные формы кислорода и радикальные соединения, повышающие сосудистую проницаемость и поддерживающие воспалительную реакцию [15][16]. Свободнорадикальные процессы являются внутриклеточными сигнальными факторами для привлечения медиаторов воспаления, вызывая нарушение целостности ядерных мембран и повреждение важных белковых молекул ДНК и РНК [17][18]. Свободные радикалы нарушают дифференцировку и пролиферацию клеток, вызывают апоптоз через путь активации матриксных металлопротеиназ и остеокластов [19]. Препятствием для их дальнейшего образования служат ферменты антиоксидантной системы. В случае компенсации антиоксидантной системы при высоком уровне свободнорадикальных процессов не происходит прогрессирования повреждения тканей сустава [20–22].

Понимание роли свободнорадикальных реакций в поддержании воспалительного процесса доказывает обоснованность назначения при ПТОА лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительным, обезболивающим и антиоксидантным действием [1][23]. Вследствие опасных для жизни нежелательных эффектов при приеме нестероидных противововспалительных средств (НПВС) возникает потребность в создании новых лекарственных веществ для патогенетической терапии воспалительно-дегенеративных заболеваний суставов. Совокупное действие разнонаправленных механизмов обеспечивает сочетание воздействия препарата на ключевые звенья патологии с протективным эффектом антиоксидантного компонента. Так достигается качественно новый лечебный эффект [24–27]. Перспективы использования препаратов с аналогичным типом воздействия на патологию костно-суставной системы особенно актуальны как будущие ориентиры научных исследований. В связи с потребностью в новых лекарственных средствах целесообразность исследований их эффективности и безопасности обоснована и заключает в себе научный потенциал.

Цель исследования — оценка влияния нового производного 3-гидроксипиридина (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-4-изобутилфенилпропаноат) на интенсивность свободнорадикальных процессов и антиоксидантную защиту при артрите посттравматического генеза в эксперименте.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Экспериментальное исследование проведено на 55 белых нелинейных крысах-самцах массой 190–220 г, полученных из биопитомника федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарёва» (ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва) в осенне-зимний период. На все партии поставляемых животных были предоставлены ветеринарные сертификаты.

Размещение и содержание

Животные содержались в экспериментальных условиях на базе вивария ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва» при естественном освещении, температуре воздуха 22–24 °С и относительной влажности 40–60% в соответствии с руководством ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) и согласно требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных (приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.2016). Животным был обеспечен постоянный доступ к воде и корму, находились по 2 особи в клетке. В качестве подстилочного материала использовались опилки из лиственных пород деревьев, подвергшиеся предварительной стерилизации в сухожаровом шкафу при 120 ºС в течение 20 мин. В помещении была установлена приточно-вытяжная система вентиляции, обеспечивающая режим проветривания.

Дизайн исследования

Исследование относится к категории рандомизированных. Все этапы исследования, включая моделирование повреждения, введение препаратов, забор биологического материала, были выполнены в условиях экспериментальной лаборатории кафедры общей хирургии им. профессора Н.И. Атясова с курсами оториноларингологии и челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВО МГУ им. Н.П. Огарёва. Блок-схема представлена на рисунке 1.

Объем выборки

Животные были поделены на 5 групп. Первую группу составили интактные крысы (n = 15). В контрольной (10 особей) и подопытных группах (30 особей) под комбинированной анестезией с использованием золетила и ксилазина гидрохлорида моделировали повреждение коленного сустава. В трех экспериментальных группах (по 10 особей в каждой группе) проводилось введение препаратов сравнения и нового производного 3-гидроксипиридина. В контрольной группе курс лечения проводился физиологическим раствором в эквивалентном объеме (3 мл).

Оценка нормальности распределения возраста и массы животных до начала манипуляций проводилась по критерию Шапиро — Уилка. Было установлено, что распределение по возрасту и массе во всех группах соответствует нормальному закону числового распределения (нулевая гипотеза не отклонена при р > 0,05). Для подтверждения сопоставимости групп по возрасту и массе использовали непараметрический дисперсионный анализ по критерию Краскела — Уоллиса (получены результаты: по возрасту р = 0,749 и по массе р = 0,713).

Однородность возраста и массы крыс оценивали с использованием критерия Краскела — Уоллиса, который показал отсутствие статистически значимых различий в значениях медиан указанных показателей исследуемых подгрупп (p = 0,749; p = 0,713 соответственно). Данные о медианах и межквартильных интервалах исследуемых подгрупп приведены в таблице 1. Кроме того, сопоставимость по породе и полу не проводилась, поскольку данные критерии были определены как обязательные при поставке животных из питомника.

Критерии соответствия

Критерии включения

В исследование включались беспородные крысы мужского пола массой 190–220 г в возрасте 3–4 месяца, без анатомических дефектов и видимой патологии. Животные предварительно выдерживали карантин в условиях вивария ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Критерии невключения

Больные животные, имеющие анатомические дефекты и видимую патологию.

Критерии исключения

Гибель особи во время проведения моделирования, появление гнойно-воспалительных изменений в области оперативного вмешательства.

Рандомизация

Рандомизация особей на контрольную и опытные серии осуществлялась случайным образом с применением метода «конвертов». Один из работников вивария выбирал животное, другой доставал из непрозрачного конверта карту с номером группы (1 (n = 15), 2 (n = 10), 3 (n = 10), 4 (n = 10), 5 (n = 10)), в которую распределялась выбранная особь. После проведения рандомизации было проверено и подтверждено статистически (см. ниже), что включенные в исследование особи всех групп были сопоставимыми по визуальному отсутствию патологий и анатомических дефектов. Значимого различия среднегрупповых показателей массы тела животных в сопоставляемых группах не наблюдалось.

Обеспечение анонимности данных

Данными о распределении особей на группы владел руководитель экспериментального исследования А.Н. Захватов. Оценка и анализ полученных данных проводились коллективом авторов без привлечения дополнительных лиц.

Итоговые показатели (исходы исследования)

В качестве итоговых показателей исследования оценивали: уровень первичных и вторичных метаболитов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых конъюгатов (ед/мл) плазмы крови, малонового диальдегида в плазме и гемолизате отмытых эритроцитов (1:10) при спонтанном (MДА) и железоиндуцированном окислении (Fe-MДA), измеряемых в мкмоль/л, показатели биохемилюминесценции (максимальная интенсивность свечения (Imax), светосумма хемилюминесценции (S), измеряемых в мВ/с). Антиоксидантный потенциал исследовался по активности каталазы в плазме и гемолизате отмытых эритроцитов (1:10), измеряемых в мккат/л, и супероксиддисмутазы (СОД) в плазме (ед. акт.).

Экспериментальные процедуры

Методика получения нового производного 3-гидроксипиридина (2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-4-изобутилфенилпропаноат)

Новое комплексное соединение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-4-изобутилфенилпропаноат (лабораторное название ЛХТ-1-20) синтезировано в отделе химии и технологии синтетических лекарственных средств и аналитического контроля АО «Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ» (патент РФ на изобретение №2814495) (рис. 2)¹.

Синтез нового производного 3-гидроксипиридина осуществлялся посредством взаимодействия эквимолярных количеств (0,020 гм) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина массой 4,13 г и 4-изобутилфенилпропановой кислоты массой 2,74 г с последующей их тщательной и гомогенизацией перемешиванием со скоростью вращения 300–400 оборотов в минуту в гомогенизаторе в течение 2 часов. На выходе получается белый кристаллический порошок в количестве 6,14 г.

Моделирование повреждения коленного сустава (посттравматического остеоартрита)

В экспериментальных группах 2–5 под комбинированной анестезией (золетил 100 в дозе 0,05 мг/кг, ксилазина гидрохлорид в дозе 1 мг/кг внутримышечно) моделировали повреждение коленного сустава. Модель повреждения коленного сустава была выполнена механическим способом в модификации Г.М. Дубровина и соавт.² После обработки операционного поля спиртовым раствором хлоргексидина осуществлялось послойное рассечение тканей. Для моделирования повреждения использовали иглу Дюфо (внешний диаметр 2,0 мм, нержавеющая сталь), рабочий конец которой был предварительно обточен под углом 90 градусов. Иглу вводили в полость коленного сустава в проекции медиального мыщелка бедренной кости до контакта с субхондральной костью, сопровождающегося усилением сопротивления. Глубина введения контролировалась мандреном с учетом толщины хрящевого матрикса. Далее игла извлекалась и производилось послойное ушивание тканей. Стандартизация повреждения обеспечивалась единой методикой, выполняемой одним оператором (А.Н. Захватов), с использованием заточенной иглы фиксированного диаметра с мандреном. Длительность формирования модели экспериментального повреждения сустава составила 28 суток.

Послеоперационное обезболивание обеспечивалось остаточным действием комбинированной анестезии (золетил + ксилазина гидрохлорид). Мониторинг состояния животных осуществлялся ежедневно: оценивали двигательную активность, пищевое поведение, состояние послеоперационной раны, массу тела.

Исследование эффективности действия 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния-4-изобутилфенилпропаноата

Во второй группе животные оставались под наблюдением, получая физиологический раствор. В третьей группе применяли ибупрофен в вводимой дозе 6,35 мг/кг, в четвертой — этилметилгидроксипиридина сукцинат (Мексидол^®, «Фармасофт») (далее ЭМГС) в дозе 45,58 мг/кг, а в пятой — ЛХТ-1-20 в дозе 11,65 мг/кг. Дозы изученного вещества и ибупрофена соответствовали 2% показателей LD₅₀, вычисленных для мышей при их внутрижелудочном введении с учетом коэффициента пересчета доз, а доза ЭМГС — 5% показателя LD₅₀.

Исследуемое новое вещество и препараты сравнения вводили внутрижелудочно с использованием эндогастрального зонда в течение 15 суток с кратностью введения 1 раз в сутки.

Оценка итоговых показателей (исходов исследования)

Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов проводилась в биологической жидкости (плазме крови), забор которой осуществлялся из подъязычной вены с последующей стабилизацией цитратом натрия в отношении 1:9.

Оценка интенсивности свободнорадикального окисления проводилась по уровню первичных и вторичных метаболитов ПОЛ — диеновых конъюгатов (ДК), определяемых модифицированным методом Плацера (1976)³ в плазме крови, малонового диальдегида в плазме и гемолизате отмытых эритроцитов (1:10) при спонтанном (MДА — малоновый диальдегид) и железоиндуцированном окислении (Fe-MДA — малоновый диальдегид при железоиндуцированном окислении), определяемых по методу С.Г. Конюховой (1989)⁴. При исследовании использовался метод биохемилюминесценции (БХЛ), реализуемый с использованием биохимического анализатора «Флюорат — 02-АБЛФ-Т» (ООО «Люмэкс», Россия). Антиоксидантный потенциал исследовался по активности каталазы в плазме и гемолизате отмытых эритроцитов (1:10), определяемой в соответствии с методикой М.А. Королюк (1988)⁵, и супероксиддисмутазы (СОД) в плазме методом Е.Е. Дубининой (1983)⁶ [19–21].

Уход за животными и мониторинг

Животные содержались в лабораторных условиях учебного вивария при постоянном доступе к пище и воде. Наблюдение за животными осуществляли в течение 28 суток. После моделирования повреждения они находились в клетке по одному. Вывод особей из экспериментального исследования осуществлялся на 28-е сутки за счет передозировки наркозом (золетил 100 + ксилазина гидрохлорид, внутримышечно).

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Размер групп (n = 10–15) определен на основании данных аналогичных экспериментальных исследований антиоксидантной терапии при моделировании остеоартрита [25].

Статистические методы

Для оценки однородности групп по критериям массы тела и возраста применяли критерий Краскела — Уоллиса. Данные проверяли на нормальность распределения по критерию Шапиро — Уилка. После оценки соответствия выборки закону нормального распределения данных производилось вычисление средних величин (М) и стандартного отклонения (SD) с последующим представлением данных в виде М ± SD. В случае отсутствия подтверждения нормальности выборочного распределения описательная статистика была представлена в виде медианы (Me), первого (Q1) и третьего (Q3) квартилей либо кратко как Me (Q1; Q3). Межгрупповые сравнения проводились с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) по критерию Фишера с постхоками Тьюки. Различия признавались статистически значимыми при p < 0,05. Конт­роль множественных сравнений внутри каждого показателя осуществлялся с помощью критерия Тьюки, интегрированного в процедуру дисперсионного анализа. С учетом множественности оцениваемых исходов (10 показателей) использован консервативный уровень статистической значимости p < 0,05, что снижает вероятность ложноположительных заключений. Результаты интерпретированы с учетом исследовательского характера анализа. Статистический анализ произведен программным комплексом SPSS Statistics 20.0 (IBM, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При изучении процессов ПОЛ при ПТОА после моделирования повреждения коленного сустава наблюдалась активация биорадикальных механизмов, характеризовавшаяся образованием первичных и вторичных продуктов липопероксидации в крови животных. При исследовании группы контроля в сравнении с аналогичными показателями интактных крыс концентрация ДК в плазме была выше на 125% (p < 0,001). Аналогично наблюдалось повышение концентрации МДА в плазме — на 106% (p < 0,001), МДА в эритроцитах — на 74% (p < 0,001) относительно показателей здоровых особей. Значение МДА при железоиндуцированном окислении (Fe-МДА) в плазме и эритроцитах также было выше на 115% (p < 0,001) и 78% (p < 0,001) соответственно (табл. 2).

Изучение антиоксидантного потенциала после моделирования повреждения коленного сустава показало снижение активности каталазы в эритроцитах у животных второй группы относительно интактной серии в 1,96 раза (p < 0,001). Каталаза в плазме была равна 0,48 ± 0,03 мккат/л, что ниже в 2,38 раза (p < 0,001) референсных значений. Активность СОД в плазме в сравнении с исходными значениями был ниже в 2,5 раза (p < 0,001) (табл. 3).

При оценке активности свободнорадикального окисления хемилюминесцентным методом в группе контроля значения максимальной интенсивности свечения (Imax) были выше в 2,14 раза (p < 0,001), а светосуммы хемилюминесценции (S) — в 1,83 раза (p < 0,001) соответственно относительно величин группы интактных животных, что свидетельствует о том, что эндогенная антиоксидантная система не обладает должной величиной потенциала, способной восстановить нарушенное равновесие в системе процессов свободнорадикального окисления. Обнаруженные повышенные уровни первичных и вторичных продуктов липопероксидации, а также Imax и светосуммы БХЛ при значительном снижении активности каталазы и СОД в плазме свидетельствуют о выраженной интенсивности процессов свободнорадикального окисления и сниженном антиоксидантном потенциале, а также указывают на необходимость фармакологической коррекции развившегося дисбаланса.

В третьей группе экспериментального исследования при внутрижелудочном введении ибупрофена наблюдалось снижение содержания продуктов ПОЛ в крови исследуемых животных. Так, уровень ДК в плазме составил 0,29 ± 0,02 ед./мл, что ниже значений второй группы на 19% (p₁ < 0,001). Аналогичные изменения затронули показатели МДА и Fe-МДА в плазме: их уровни составили 9,07 ± 0,53 и 17,69 ± 0,43 мкмоль/л соответственно, что было значимо ниже аналогичных данных второй группы на 14% (p₁ < 0,001) и 21% (p₁ < 0,001) соответственно. Оценка показателей МДА и Fe-МДА в гемолизате отмытых эритроцитов показала уменьшение их уровней относительно значений контрольной серии на 16% (p₁ < 0,001) и 10% (p₁ < 0,001) соответственно.

Исследование антиоксидантного потенциала в третьей группе показало повышение активности основных энзимов. Так, активность каталазы в эритроцитах увеличилась по сравнению со значением во второй группе в 1,24 раза (p₁ = 0,002), каталазы в плазме — в 1,2 раза (p₁ < 0,001), а СОД в плазме — в 1,23 раза (p₁ = 0,001). Данные изменения могут свидетельствовать о частичном восстановлении нарушенного равновесия в системе свободнорадикального окисления.

Подтверждение этих изменений было получено при проведении биохемилюминесцентного исследования. Оцениваемые показатели биохемилюминесценции Imax и S в сравнении с аналогичными показателями второй группы были ниже на 12% (p₁ < 0,001) и 17% (p₁ < 0,001) соответственно.

Статистически более значимая положительная динамика наблюдалась у животных четвертой группы при эндогастральном введении ЭМГС. Уровень первичного продукта липопероксидации ДК в плазме определялся на 44% (p₁ < 0,001) ниже в сравнении со второй группой. Показатели МДА и Fe-МДА в плазме составили 6,35 ± 0,27 и 13,43 ± 0,33 мкмоль/л соответственно, что было значимо ниже значений второй группы на 40% (p₁ < 0,001) и 40% (p₁ < 0,001) соответственно. Содержание МДА и Fe-МДА в эритроцитах снижалось относительно аналогичных значений серии второй группы на 29% (p₁ < 0,001) и 32% (p₁ < 0,001) соответственно. Активность каталазы в эритроцитах превышала значения второй группы на 65% (p₁ < 0,001), в плазме — в 73% (p₁ <0,001). Значение СОД в плазме было выше аналогичных показателей группы контроля на 40% (p₁ < 0,001). Проведенный биохемилюминесцентный анализ выявил подтверждение определяемых изменений. Наблюдалось понижение показателей БХЛ в сравнении со второй группой: Imax — на 39% (p₁ < 0,001), S — на 35% (p₁ < 0,001) соответственно.

Введение соединения ЛХТ-1-20 в пятой группе экспериментального исследования приводило к коррекции оксидативного стресса, приближая оцениваемые показатели к референсным значениям. Величина ДК в плазме крови определялась ниже второй группы на 56% (p₁ < 0,001), значимо не отличаясь от данных группы интактных животных (p = 0,982). Значения МДА и Fe-МДА в плазме составили 5,92 ± 0,23 и 12,50 ± 0,50 мкмоль/л соответственно, что ниже значений контрольной группы на 44% (p₁ < 0,001) и 44% (p₁ < 0,001) соответственно. При сравнительном анализе с первой группой значения МДА и Fe-МДА в плазме превышали референсные показатели на 16% (p < 0,001) и 20% (p < 0,001) соответственно. Уровни МДА и Fe-МДА в эритроцитах снизились относительно аналогичных показателей второй группы на 36% (p₁ < 0,001) и 34% (p₁ < 0,001) соответственно. Показатель МДА в эритроцитах при спонтанном окислении липидов был выше на 12% (p < 0,001), Fe-МДА в эритроцитах — на 18% (p < 0,001). Активность каталазы в эритроцитах превышала значения второй группы в 1,77 раза (p₁ < 0,001) и значимо не отличалась от соответствующего значения интактных крыс (p = 0,150). Ее активность в плазме преобладала над значением контрольной группы на 88% (p₁ < 0,001), но на 21% (p < 0,001) была ниже соответствующего референсного значения. В свою очередь, активность СОД в плазме при введении ЛХТ-1-20 была в 2,29 раза (p₁ < 0,001) выше аналогичного показателя серии контроля, значимо не отличаясь от данных интактной серии (p = 0,001). В пятой группе показатели биохемилюминесценции Imax и S снизились в 1,69 раза (p₁ < 0,001) и в 1,75 раза (p₁ < 0,001) соответственно относительно аналогичных значений контрольной группы. В сравнении с первой группой максимальная интенсивность свечения была выше на 27% (p < 0,001), величина S значимо не отличалась от референсных значений (p = 0,007).

При проведении сравнительного анализа показателей пятой группы с показателями третьей группы определялось более выраженное корригирующее влияние на показатели свободнорадикального окисления. Так, уровень ДК был ниже на 45% (p₂ < 0,001), показатели МДА при спонтанном окислении в плазме и эритроцитах — на 35% (p₂ < 0,001) и 24% (p₂ < 0,001) соответственно, Fe-МДА в плазме и эритроцитах при железоиндуцированном окислении — на 29% (p₂ < 0,001) и 26% (p₂ < 0,001). Оценка активности ферментов антиоксидантной защиты выявила более выраженное восстановление исследуемых показателей: активность каталазы в плазме и эритроцитах была выше на 53% (p₂ < 0,001) и 43% (p₂ < 0,001) соответственно, активность СОД в плазме — на 86% (p₂ < 0,001) относительно серии применения ибупрофена. Данные изменения подтверждались данными БХЛ: в сравнении с третьей группой максимальная интенсивность свечения при применении ЛХТ-1-20 была ниже на 33% (p₂ < 0,001), величина S — на 32% (p₂ < 0,001).

Сравнительная оценка применения нового соединения ЛХТ-1-20 с четвертой группой выявила статистически значимые различия оцениваемых показателей процессов ПОЛ. ДК оказался ниже на 20% (p₃ < 0,001), МДА плазмы и эритроцитов — на 7% (p₃ = 0,048) и 9% (p₃ = 0,041), соответственно. Показатели антиоксидантной системы восстанавливались с превышением их уровней над аналогичными значениями четвертой группы. Активность каталазы в плазме была выше на 8% (p₃ = 0,041), СОД в плазме — на 37% (p₃ < 0,001) соответственно. Показатель светосуммы БХЛ также подтверждал определяемый рост антиоксидантного потенциала, увеличиваясь на 12% (p₃ = 0,028).

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация / научная значимость

В результате проведенного исследования выявлено, что экспериментальный посттравматический артрит сопровождается активацией процессов свободнорадикального окисления через механизм респираторного взрыва с образованием биорадикалов, оказывающих мембранодеструктивное действие с прогрессированием воспалительного процесса и истощением антиоксидантного потенциала. Это опосредуется значительным ростом ДК, МДА при спонтанном и железоиндуцированном окислении, снижением активности супероксиддисмутазы и каталазы. Наблюдалось повышение показателей максимальной интенсивности свечения и светосуммы БХЛ.

Применение ибупрофена не приводило к значимому снижению показателей ПОЛ в сравнении с серией конт­роля, как и восстановлению антиоксидантного потенциала. Однако оно способствовало некоторому ограничению дальнейшего роста продуктов липопероксидации. Полученные данные свидетельствуют об ограничении хемотаксической миграции в очаг воспаления нейтрофилов, угнетении их деструкции с выходом лизосомальных ферментов во внеклеточный матрикс и ограничению их патологического действия на соединительнотканные структуры сустава. Вместе с тем сохраняющиеся высокие уровни первичных и вторичных продуктов липопероксидации говорят о наличии недостаточной антиоксидантной активности НПВС и о его неполноценном корригирующем влиянии на нарушенный баланс в системе свободнорадикального окисления. Кроме того, это нашло свое подтверждение при проведении биохемилюминесцентного исследования, при котором выявлялись сохраняемые высокие показатели максимальной интенсивности свечения и светосуммы хемилюминесценции. После проведенной терапии отмечалось некоторое восстановление активности антиоксидантного потенциала, что может являться следствием ограничения деструкции нейтрофилов. Однако монотерапия ибупрофеном не приводила к полному восстановлению активности антиоксидантных энзимов, находящихся к концу эксперимента в своем регрессивном состоянии.

В ходе проведенного исследования доказана эффективность препарата ЭМГС при ПТОА вследствие его антиоксидантного и мембранопротекторного действия. На фоне его применения наблюдалось повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы, снижение липопероксидации и концентрации эндопероксидов, однако оцениваемые маркеры существенно превышали значения животных интактной группы. Эти изменения обусловлены наличием у данного препарата способности к активному реагированию с первичными и гидроксильными радикалами пептидов, а также стимуляции эндогенной актиоксидантной системы посредством повышения активности основных ее энзимов: каталазы и супероксиддисмутазы, отвечающих за нейтрализацию активных форм кислорода. Данные изменения нашли свое подтверждение при проведении биохемилюминесцентного анализа, характеризующегося снижением показателей максимальной интенсивности свечения и светосуммы хемилюминесценции. Однако, несмотря на определяемую положительную динамику, должного снижения уровней первичных и вторичных продуктов липопероксидации, а также увеличения активности ферментов антиоксидантной защиты не происходило.

При определении влияния нового соединения ЛХТ-1-20 на активность процессов свободнорадикального окисления при его пероральном зондовом применении на протяжении всего наблюдения определялось более эффективное ингибирование данных процессов, а также увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты в сравнении с сериями применения ибупрофена и ЭМГС. Полученные результаты демонстрируют превосходство применения данного соединения над монотерапией препаратами сравнения. Данные изменения обусловлены потенцированием основных лечебных эффектов данного соединения. Так, за счет наличия противовоспалительной активности наблюдалась стабилизация лизосомальных мембран клеток и угнетение воспалительных реакций. Антиоксидантные свойства способствовали угнетению свободнорадикальных механизмов повреждения в области суставных тканей, а также более быстрому восстановлению активности ферментов антиоксидантной защиты. Это дает возможность предположить, что основным различием в фармакодинамике изученного соединения и ЭМГС является более выраженное противовоспалительное действие ЛХТ-1-20, которое может проявляться и на моделях других заболеваний с выраженным воспалительным компонентом.

Ограничения исследования

Настоящее исследование имеет ряд ограничений. Период наблюдения составил 28 суток, что не позволяет оценить отдаленные последствия применения исследуемых препаратов. Использование нелинейных крыс обусловливает большую генетическую вариабельность по сравнению с инбредными линиями, что может влиять на воспроизводимость результатов. В работе не оценивались функциональные исходы (подвижность сустава, болевая чувствительность).

Оценка эффективности исследуемых препаратов ограничена биохимическими маркерами оксидативного стресса в крови. Морфологическая верификация состояния суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондральной кости (гистологическое исследование, окраска по Сафранину-О, оценка по шкалам OARSI/Mankin) не проводилась. Полученные результаты характеризуют влияние изученных препаратов на системные показатели свободнорадикального окисления и не могут быть экстраполированы на структурные изменения сустава. Морфологическая верификация является предметом дальнейших исследований.

Фармакокинетический профиль ЛХТ-1-20 (биодоступность, объем распределения, период полувыведения) не изучался, что ограничивает интерпретацию дозозависимых эффектов.

Post-hoc анализ мощности (G*Power 3.1, F-test, ANOVA one-way, 5 групп) при наблюдаемом размере эффекта f = [ 1,51], уровне значимости alpha = 0,001 и общем объеме выборки N = 55 показал мощность [ 1 – beta] = [ 0,99]. Минимальный детектируемый размер эффекта при заданных параметрах составил f = [ 0,87], что ниже наблюдаемых межгрупповых различий по всем исследуемым показателям.

Кроме того, экстраполяция результатов экспериментального исследования на человека ограничена видовыми различиями в метаболизме и иммунном ответе.

Обобщаемость/экстраполяция

Известно, что в патогенезе развития посттравматического остеоартрита отводится роль процессам ПОЛ с выработкой большого количества свободных радикалов, обладающих мембранодеструктивным действием [11–14]. При моделировании травматического повреждения сустава было выявлено преобладание процессов свободнорадикального окисления, что подтверждалось повышением уровней первичных и вторичных продуктов липопероксидации с одновременным угнетением активности антиоксидантной системы. Выявленные изменения подтверждались данными биохемилюминесценции.

Применение нового производного 3-гидроксипиридина ЛХТ-1-20 способствовало угнетению свободнорадикальных механизмов повреждения, что подтверждалось уменьшением уровней продуктов липопероксидации. Наряду с данными изменениями наблюдалось увеличение активности ферментов антиоксидантной защиты. В сравнении с третьей и четвертой группами, в которых проводилась монотерапия ибупрофеном и мексидолом соответственно, отмечалось более выраженное корригирующее влияние на вышеуказанные процессы при эндогастральном введении нового соединения. Данные изменения обусловлены потенцированием основных лечебных эффектов, а именно: противовоспалительная активность способствует стабилизации лизосомальных мембран [11][12], антиоксидантная активность приводила к угнетению свободнорадикальных механизмов повреждения и увеличению активности основных ферментов антиоксидантной системы [13].

Таким образом, обнаруженная ранее роль ПОЛ в патогенезе изучаемой патологии обосновывает необходимость применения препарата, обладающего не только противовоспалительной, но и антиоксидантной активностью, что будет способствовать в последующем ограничению воспалительных изменений в поврежденных суставных тканях и предупреждению прогрессирования посттравматического остеоартрита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при экспериментальном травматическом повреждении сустава наблюдается активация свободнорадикальных процессов, ведущих к прогрессированию посттравматического остеоартрита. Образующие активные формы кислорода оказывают повреждающее действие на соединительнотканные структуры сустава, а также запускают цепь реакций перекисного окисления липидов, которые, в свою очередь, ведут к повреждению клеточных мембран сустава с высвобождением митохондриальных элементов и формированию альтернативных изменений в суставных тканях. В результате возникающего дисбаланса угнетается антиоксидантный потенциал, усугубляется деструктивное влияние свободных радикалов на ткани сустава. Возникающие патологические изменения, характеризующиеся интенсификацией свободнорадикальных процессов и истощением активности антиоксидантных энзимов, требуют их фармакологической коррекции. Новое соединение ЛХТ-1-20 обладает выраженными антиоксидантными свойствами. Его применение будет способствовать торможению процессов свободнорадикального повреждения суставных тканей, более быстрому восстановлению антиоксидантного потенциала как за счет повышения активности основных энзимов, так и за счет уменьшения в количественном отношении свободных радикалов, однако подтверждение структурного эффекта требует морфологической верификации.