Влияние микронизированной очищенной фракции флавоноидов на воспаление и ремоделирование внеклеточного матрикса при лимфедеме у крыс: доклиническое экспериментальное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Долгое время предполагалось, что повреждение лимфатической системы и ее неспособность к регенерации являются определяющими чертами патофизиологии лимфедемы. Однако эта концепция не объясняет характерную временную динамику заболевания: у большинства пациентов лимфедема развивается с задержкой — через месяцы, а иногда и годы после хирургического вмешательства, лучевой терапии или травмы [1]. Этот клинический парадокс указывает на то, что повреждение лимфатической системы является лишь инициирующим событием, а для полной манифестации заболевания необходимы вторичные патологические процессы, включая хроническое воспаление, тканевой фиброз и нарушение гомеостаза внеклеточного матрикса (ВКМ) [1–5].

Современная патофизиологическая модель, предложенная C.L. Ly et al. [5], уточняет эту последовательность (рис. 1): накопление белковой лимфатической жидкости в интерстициальном пространстве кожи и подкожной клетчатки индуцирует воспалительную реакцию и адипогенез, что запускает каскад молекулярных событий, ведущих к прогрессирующей лимфатической недостаточности. Ключевую роль в этом процессе играет активация CD4⁺ T-лимфоцитов (CD — кластер дифференцировки; англ. cluster of differentiation), которая, как показано в экспериментальных моделях, является необходимой и достаточной для развития лимфедемы. Активированные CD4⁺ T-клетки дифференцируются в T-хелперы 2-го типа (Th2) и секретируют цитокины интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), а также стимулируют продукцию трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1). Эти медиаторы прямо или косвенно способствуют лимфатической дисфункции, вызывая фиброз тканей за счет активации фибробластов и усиленного отложения коллагена, замедление лимфотока из-за уплотнения интерстиция, нарушение формирования коллатеральных лимфатических сосудов, увеличение проницаемости микроциркуляторного русла, что усугубляет застой. Кульминацией этого патологического каскада становится ухудшение лимфатического застоя, который, в свою очередь, поддерживает воспаление — формируется замкнутый порочный круг [6].

Лимфедема также сопровождается структурными изменениями ВКМ: накопление макромолекул в интерстиции приводит к активации фибробластов и кератоцитов, дисбалансу в синтезе коллагеновых волокон (типов I и III) и эластина, а также к нарушению архитектоники дермы [6][7]. Особое значение приобретает тот факт, что Th2-цитокины IL-4 и IL-13 напрямую участвуют в патогенезе лимфедемы, подавляя лимфангиогенез и стимулируя дифференцировку фибробластов, что приводит к фиброзу [5][8][9]. Их пролонгированная экспрессия не только способствует фиброзу, но и напрямую подавляет регенерацию лимфатической сети, делая процесс лимфедемы потенциально необратимым. Исследования показывают, что фиброз при лимфедеме опосредован не только активацией фибробластов, но и эпителиально-мезенхимальным переходом кератиноцитов под действием TGF-β, что приводит к миграции клеток в дерму и формированию зрелого коллагенового каркаса [7][10].

Недавние исследования показали, что нарушения в системе комплемента могут усиливать инфильтрацию CD4⁺ T-клеток и усугублять лимфедему, что дополнительно подчеркивает роль адаптивного иммунного ответа в патогенезе заболевания [11].

В этом контексте поиск терапевтических стратегий [12][13], направленных на модуляцию Th2-воспаления и ремоделирование ВКМ, становится приоритетом [3][5]. Микронизированная очищенная фракция флавоноидов (МОФФ) — препарат, содержащий диосмин и гесперидин. Данные лекарственные вещества оказывают комплексное воздействие на сосудистую систему. Они обладают венотонизирующим эффектом, обеспечивают контроль проницаемости сосудистой стенки за счет снижения воспалительной экссудации, что способствует улучшению лимфатического дренажа [14–16]. На сегодняшний день доказано положительное воздействие МОФФ не только на венозный тонус, но и на проницаемость капилляров, лимфатический дренаж. Тонизирующий эффект МОФФ заключается в воздействии на лимфатические сосуды через норадреналиновые рецепторы. Это достигается путем усиления и продления чувствительности сосудистой стенки к катехоламинам [14–16]. Однако его влияние на молекулярные механизмы лимфедемы остается недостаточно изученным.

Цель исследования — оценить влияние микронизированной очищенной фракции флавоноидов на ключевые маркеры Th2-воспаления (интерлейкин-4), протеолиза (матриксную металлопротеиназу-2) и метаболизма коллагена (проколлаген III типа, карбокситерминальный пропептид коллагена I типа) в коже крыс с экспериментальной лимфедемой.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Объектом эксперимента послужили самцы генетически неконтролируемой закрытой колонии нелинейных крыс Wistar (n = 49) весом 250–300 г, полученные из питомника «Столбовая» — филиала федерального государственного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий федерального медико-биологического агентства».

Размещение и содержание

Животные содержались в условиях вивария федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России) в соответствии с соблюдением всех этических норм и стандартов, включая требования ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009 «Медицинские изделия. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными», руководство ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments), Хельсинкскую декларацию, «Правила по уходу и использованию лабораторных животных», а также Директиву ЕС 86/609/EEC и Конвенцию Совета Европы по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, группами по 3 особи в вентилируемых клетках для крыс на стандартном водном и пищевом рационе, со свободным доступом к пище и воде, при регулируемом совмещенном световом режиме (12/12 ч) и температуре 20–22 ºС. В ходе проведения эксперимента было обеспечено гуманное отношение к животным.

Дизайн исследования

Работа отнесена к рандомизированным исследованиям. Оперативные вмешательства, введение лекарственного препарата и забор биологического материала осуществлялись в условиях вивария. Выполнение лабораторного этапа проводилось на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. Дизайн исследования изображен на рисунке 2.

Объем выборки

Исследование включало 49 животных. У 42 животных была смоделирована лимфедема на левой тазовой конечности по описанной методике¹ [17]. Для контроля исследования была выделена отдельная группа (n = 7) — интактный контроль (здоровые животные).

Предварительно проведенный анализ на нормальность распределений для величин возраста и массы крыс в группах по критерию Шапиро — Уилка показал, что значимость нормального закона распределения числовых значений по возрасту отклоняется во всех группах крыс (р < 0,05). В случае распределения числовых значений по массе соответствие нормальному закону не отклонено (р > 0,05). Для доказательства того факта, что возраст и масса крыс сопоставимы в группах, применялся параметрический метод сравнения по критерию One-way ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ) для сравнения средних значений массы в группах, а для сравнения медиан возраста в группах применяли критерий Краскела — Уоллиса. Результаты проверки однородности групп сравнения приведены в таблице 1. Для возраста различия в значениях медиан и для массы различия в средних значениях для различных групп крыс статистически не значимы: р = 0,6499 и р = 0,3648 соответственно.

Критерии соответствия

Критерии включения

В исследование включались крысы Wistar массой от 250 до 300 г, мужского пола, в возрасте трех месяцев.

Критерии невключения

Животные с видимыми патологиями в физическом развитии (особенно задних конечностей), травмами, проявлениями кожных заболеваний.

Критерии исключения

Гибель животного в ходе проведения оперативного вмешательства, дальнейшего проведения процедур и наблюдения.

Рандомизация

В соответствии с критериями включения было отобрано 49 животных. 42 животных составили опытную группу, 7 животных — группу контроля. В ходе исследования из опытной группы были сформированы 2 подгруппы животных. Рандомизация животных в группы осуществлялась методом компьютерной генерации случайных чисел с использованием программного обеспечения Microsoft Excel. Каждому из 49 животных присваивали уникальный идентификационный номер, после чего с помощью функции = СЛУЧИСЛО генерировали индивидуальное случайное значение. Затем весь список животных сортировали по возрастанию сгенерированных значений. Первые 7 животных в отсортированном списке включали в группу интактного контроля, последующее 21 животное — в группу контроля патологии (без терапии), а оставшееся 21 животное — в группу терапии МОФФ.

Обеспечение анонимности данных

Информацией о распределении животных на группы располагал Д.А. Максаев — автор. Оценка результатов и анализ полученных данных проводились коллективом авторов без введения дополнительных лиц.

Итоговые показатели (исходы исследования)

Итоговым показателем исследования явилась оценка влияния МОФФ на ключевые маркеры Th2-воспаления (IL-4), протеолиза (MMP-2) и метаболизма коллагена (PIIINP, PICP) в коже крыс с экспериментальной лимфедемой.

Экспериментальные процедуры

Метод моделирования лимфедемы выполнялся под внутримышечным наркозом (Золетил + Ксила) у 42 животных, которые на этапе первичной рандомизации были распределены в группу контроля патологии (группа контроль МОФФ) (n = 21) и группу терапии МОФФ (группа МОФФ) (n = 21). После эпиляции волосяного покрова выполнялся разрез длиной до 1 см в подколенной области, выделение регионарного подколенного лимфатического узла и его иссечение вместе с окружающей подкожно-жировой клетчаткой. Также выполнялся разрез до 3 см в паховой области и иссечение подкожно-жировой клетчатки с паховыми лимфатическими узлами. Послеоперационные раны зашивались узловым швом. Моделирование осуществлялось в течение 1 месяца. Успешность формирования модели хронической лимфедемы верифицировали макроскопически (путем динамического измерения объема пораженной конечности) и гистологически (наличие характерных признаков отека, фиброза и клеточной инфильтрации). Однако, поскольку целью настоящего исследования являлась исключительно оценка молекулярных механизмов (экспрессии белковых маркеров методом иммуноблоттинга), данные морфометрии и гистологического анализа не включены в основные результаты данной рукописи, чтобы сохранить фокус на молекулярных аспектах.

Через 1 месяц после оперативного вмешательства животным группы контроля патологии (n = 21) назначали стандартный рацион без фармакотерапии, а животным группы терапии МОФФ (n = 21) проводили ежедневный пероральный прием МОФФ в виде суспензии в дозе 93 мг/сут на протяжении шести месяцев. Суточная доза препарата была рассчитана на основании «Руководства по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ»². За основу взята клиническая доза 1000 мг/сут для человека (при массе 70–75 кг → 14,29 мг/кг). С учетом межвидового коэффициента для крыс (6,5) расчетная доза составила 93 мг/сут. В связи с терминальным дизайном забор биоматериала проводили в сроки 1, 3 и 6 месяцев (n = 7 на группу / временную точку).

Для молекулярного анализа были выделены 10 подгрупп образцов кожи бедра (рис. 2): (1) —интактный контроль (здоровые животные), левая нижняя конечность (Л н/к) (n = 7); 1(2) — здоровая правая тазовая конечность (П н/к) у животных группы МОФФ (1 мес.) (n = 7 конечностей); 1(3) — Л н/к (с лимфедемой) у группы животных без фармакотерапии (1 мес.) (n = 7 конечностей); 1(4) — Л н/к (с лимфедемой) у животных группы МОФФ (1 мес.) (n = 7 конечностей); 3(5) — здоровая П н/к у животных группы МОФФ (3 мес.) (n = 7 конечностей); 3(6) — Л н/к (с лимфедемой) у группы животных без фармакотерапии (3 мес.) (n = 7 конечностей); 3(7) — Л н/к (с лимфедемой) у животных группы МОФФ (3 мес.) (n = 7 конечностей); 6(8) — здоровая П н/к у животных группы МОФФ (6 мес.) (n = 7 конечностей); 6(9) — Л н/к (с лимфедемой) у группы животных без фармакотерапии (6 мес.) (n = 7 конечностей); 6(10) — Л н/к (с лимфедемой) у животных группы МОФФ (6 мес.) (n = 7 конечностей).

Перед иссечением участка кожи шерсть была тщательно удалена, после чего проводили забор образца кожи (зона бедра крыс Wistar). Гомогенизацию образцов проводили в гомогенизаторе Potter-Elvehjem. Навеску ткани (60 мг) помещали в предварительно охлажденный гомогенизатор и добавляли 60 мкл охлажденного лизирующего буфера NP-40 Cell Lysis Buffer (Thermo Fisher Scientific, США) в соотношении 1:1 (вес/объем) с добавлением смеси ингибиторов протеиназ. Гомогенизацию проводили при +4°C, выполняя 16–20 плавных вертикальных перемещений пестика без вращения для минимизации повреждения клеточных мембран. Супернатант, представляющий собой фракцию цитоплазматических белков, переносили в чистые пробирки. Содержание белка в полученном гомогенате определяли методом Брэдфорда [18]. Далее 25 мкг белка смешивали с буфером Лэммли (Bio-Rad, США), содержащим β-меркаптоэтанол, денатурировали при 70 °C в течение 10 мин и разделяли методом электрофореза в 7,5% поли­акриламидном геле (TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, Bio-Rad, США) при 100 В. Белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, США) в системе для полусухого трансблоттинга Mini Trans-Blot (Bio-Rad, США) (25 В, 1,3 А, 10 мин). После блокирования в 1% растворе EveryBlot Blocking Buffer (Bio-Rad, США) с 0,1% Tween-20 мембрану инкубировали с первичными моноклональными антителами к IL-4, MMP-2, PIIINP, PICP и GAPDH (Антитело к IL-4, Affinity, КНР, AF5142; Антитело к MMP-2, Affinity Biosciences, КНР, AF5330). Поликлональное антитело к PIIINP, Cloud-Clone, КНР, PAA573Ra08; Поликлональное антитело к PICP, Cloud-Clone, КНР, PAA570Hu01) (разведение 1:1000), а затем с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Invitrogen, США; разведение 1:4000). Сигнал визуализировали с помощью хемилюминесцентного субстрата на системе ChemiDoc XRS + (Bio-Rad, США) и анализировали денситометрически в программе Image Lab (Bio-Rad, США). Молекулярные массы определяли с использованием набора маркеров Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad, США). Содержание целевых белков рассчитывалось относительно белка GAPDH, выражалось в процентах.

Уход за животными и мониторинг

Животные содержались в условиях вивария со свободным доступом к пище и воде, после оперативного вмешательства животные экспериментальных групп (2–5) содержались по 1 животному в клетке. По окончании исследований крыс из эксперимента выводили под общей анестезией с применением препаратов Золетил в дозировке 60 мг/кг и ксилазина гидрохлорид — 6 мг/кг, внутримышечно.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

Размер выборки (n = 7 на подгруппу) был выбран на основе предварительных пилотных исследований и данных литературы [13], где показано, что при n ≥ 6 достигается статистическая мощность > 80% для выявления различий не менее 30% в уровнях экспрессии изучаемых молекулярных маркеров (IL-4, MMP-2, PIIINP, PICP) при уровне значимости α = 0,05 в аналогичных экспериментальных моделях лимфедемы у крыс.

Статистические методы

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием программного пакета GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). До начала лабораторного этапа исследования был определен план статистического анализа. В качестве первичного исхода выбран уровень IL-4 в коже пораженной конечности через 6 месяцев. Вторичными исходами являлись уровни MMP-2, PIIINP и PICP в те же сроки. Сравнение между контрольной и терапевтической группами планировалось проводить отдельно для каждого временного момента (1, 3 и 6 месяцев). Проверка допущений параметрических тестов проводилась для каждой из 10 подгрупп отдельно: нормальность распределения оценивали по критерию Шапиро — Уилка, а гомогенность дисперсий — по критерию Левена. Критерий Левена выявил статистически значимое неравенство дисперсий (гетероскедастичность) между группами для большинства маркеров. В связи с нарушением допущений параметрического анализа межгрупповые сравнения проводились с использованием непараметрического критерия Краскела — Уоллиса с последующим post-hoc тестом Данна для попарных сравнений. Для контроля уровня ошибки I рода при множественных попарных сравнениях внутри каждого временного момента применялся post-hoc тест Данна, содержащий встроенный алгоритм коррекции. Кроме того, с учетом поправки Бонферрони на множественность оцениваемых показателей (4 маркера на 3 временных точки), строгий скорректированный порог значимости составил бы α = 0,0042. Это не влияет на интерпретацию результатов, поскольку все фактические значения p < 0,0001.

Для оценки взаимосвязи между молекулярными маркерами рассчитывали ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Размер эффекта оценен с помощью коэффициента Cohen’s d. Интерпретацию силы эффекта проводили согласно численным критериям J. Cohen (1988): значения около 0,2 расценивали как малый эффект, 0,5 — как средний эффект, 0,8 и более — как большой эффект. Уровень статистической значимости установлен как p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе шестимесячного исследования не было зарегистрировано гибели животных или других оснований для исключения из исследования. Все 49 крыс успешно завершили эксперимент, что обеспечило 100% сохранность выборки, и данные от всех подвергнуты статистическому анализу. Молекулярный анализ экспрессии белковых маркеров методом иммуноблоттинга проводили по 10 сформированным подгруппам образцов кожи бедра. Такая детализация позволила оценить не только статическое состояние, но и временную динамику (1, 3 и 6 месяцев) развития патологического процесса при лимфедеме, а также выявить характер влияния терапии препаратом МОФФ (табл. 2). За 100% принято содержание маркеров в коже интактных животных (подгруппа 1). Обобщенные данные для всех подгрупп отображены в таблице 2.

Следует подчеркнуть, что, несмотря на статистически значимое снижение, уровни всех исследуемых маркеров в группе МОФФ оставались выше значений интактного контроля (табл. 2). Это указывает на модуляцию патологического ремоделирования с тенденцией к нормализации, однако полная коррекция молекулярных нарушений в рамках 6-месячного срока наблюдения не была достигнута.

Важно отметить, что уровни всех исследуемых маркеров в здоровых правых конечностях у животных, получавших МОФФ (подгруппы 2, 5, 8), статистически не отличались от интактного контроля (p > 0,05). Данный факт свидетельствует об отсутствии системного токсического или неспецифического действия препарата на непораженные ткани и подтверждает локальный характер патологического процесса при лимфедеме.

Интерлейкин-4 — ключевой маркер Th2-воспаления

В коже конечности с лимфедемой без лечения (подгруппа 3) через 1 месяц после формирования модели отмечалось значимое повышение IL-4, медиана которого составила 520,3% (p < 0,0001 по сравнению с интактным контролем). К 3 месяцам (подгруппа 6) уровень IL-4 возрастал на 23,0% относительно подгруппы 3, а к 6 месяцам (подгруппа 9) наблюдалось некоторое снижение уровня по сравнению с пиковым значением в 3 месяца (на 35,2%), однако медиана оставалась существенно выше интактного контроля (415,0%). На фоне терапии МОФФ (группы 4, 7, 10; рис. 3Б, отмечено зеленым) наблюдалось выраженное и значимое подавление IL-4 на всех сроках наблюдения: через 1 месяц на 38,5% (p < 0,0001 vs (лат. versus — против) группа 3), через 3 месяца на 50,0% (p < 0,0001 vs группа 6); через 6 месяцев на 49,3% (p < 0,0001 vs группа 9).

Динамика изменений на фоне терапии носила нелинейный характер: для маркера Th2-воспаления наибольшее снижение относительно контрольной группы было зафиксировано к 3–6 месяцам наблюдения. При этом, несмотря на значимую положительную динамику, показатели в группе МОФФ не достигали значений интактного контроля. Уровень IL-4 в здоровой правой конечности у животных, получавших МОФФ (группы 2, 5, 8; рис. 3Б, отмечено синим), не отличался от интактного контроля (p > 0,05) (рис. 3Б, отмечено красным). Результаты отражены на рисунке 3.

Матриксная металлопротеиназа-2 — маркер нарушения целостности микроциркуляторного барьера

В контроле без лечения MMP-2 значимо возрастал к 1 месяцу — на 127,1% относительно интактного контроля, к 3 месяцам дополнительно на 94,4% относительно 1 месяца (подгруппа 6 vs 3), к 6 месяцам еще на 3,6% по сравнению с 3 месяцами (подгруппа 9 vs 6), (p < 0,0001 на всех сроках vs контроль). Терапия МОФФ достоверно подавляла экспрессию MMP-2 на всех сроках, причем степень подавления сохранялась стабильной в динамике: 1 месяц — снижение на 41,8% (p < 0,0001 vs подгруппа 3); 3 месяца — снижение на 37,3% (p < 0,0001 vs подгруппа 6); 6 месяцев — снижение на 26,2% (p < 0,0001 vs подгруппа 9). В здоровых конечностях (группы 2, 5, 8; рис. 4Б, отмечено оранжевым) MMP-2 оставался в пределах нормы (94,0–100,0%; p > 0,05). Результаты отражены на рисунке 4.

Проколлаген III типа — маркер активного фиброза

Маркер синтеза коллагена III типа демонстрировал наиболее выраженный фибротический ответ в контроле: к 1 месяцу повышение на 321,1% (p < 0,0001 vs подгруппа 1), к 3 месяцам дополнительный рост на 77,0% относительно 1 месяца (подгруппа 6 vs 3), что соответствовало пику фиброза, максимальной активации фибробластов и интенсивному синтезу коллагена III типа. К 6 месяцам отмечалось снижение на 24,4% по сравнению с пиковым значением в 3 месяца (подгруппа 9 vs 6).

МОФФ значимо снижал PIIINP на всех сроках: 1 месяц — на 43,3% (p < 0,0001 vs подгруппа 3); 3 месяца — на 38,6% (p < 0,0001 vs подгруппа 6); 6 месяцев — на 36,4% (p < 0,0001 vs подгруппа 9). Значения в здоровых конечностях (группы 2, 5, 8; рис. 5Б, отмечено желтым) не отличались от контроля (98,1–101,9%; p > 0,05). Результаты отражены на рисунке 5.

Карбокситерминальный пропептид коллагена I типа — маркер созревания коллагена I типа

Уровень PICP, отражающий созревание коллагена I типа, патологически повышался при лимфедеме: к 1 месяцу — на 290,0% относительно интактного контроля (подгруппа 3 vs 1), к 3 месяцам на 31,3% относительно 1 месяца (подгруппа 6 vs 3), к 6 месяцам снижался на 19,5% по сравнению с 3 месяцами (подгруппа 9 vs 6). На фоне МОФФ наблюдалось значимое снижение: 1 месяц — на 25,6% (p < 0,0001 vs подгруппа 3); 3 месяца — на 38,3% (p < 0,0001 vs подгруппа 6); 6 месяцев — на 39,3% (p < 0,0001 vs подгруппа 9). В здоровых конечностях (группы 2, 5, 8; рис. 6Б, выделено синим) PICP оставался на уровне 97,5–100,0% (p > 0,05 vs интактный контроль). Результаты отражены на рисунке 6.

Для оценки клинической значимости терапии МОФФ рассчитан размер эффекта (Cohen’s d). Ко всем маркерам в 6 месяцев наблюдался очень большой эффект терапии (полученные значения существенно превышают пороговое значение 0,8, принятое за большой эффект): для IL-4 — d = 3,23, для MMP-2 — d = 2,15, для PIIINP — d = 1,67, для PICP — d = 1,68. Это указывает не только на статистическую, но и на практическую значимость терапии МОФФ по влиянию на экспрессию молекулярных маркеров, отражающих процессы воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса. Анализ динамики показал, что все четыре маркера демонстрировали четкую временную последовательность изменений. Пик экспрессии IL-4, MMP-2, PIIINP и PICP в контроле приходился на 3-й месяц эксперимента, после чего наблюдалась частичная стабилизация к 6 месяцу. В группе МОФФ на всех сроках отмечалось достоверное снижение всех маркеров по сравнению с соответствующими контрольными подгруппами. Наибольший терапевтический эффект к 6-му месяцу был зафиксирован для IL-4 (снижение на 49,3%), что сопровождалось параллельным уменьшением фибротических маркеров (PIIINP — на 36,4%, PICP — на 39,3%) и маркера нарушения барьера (MMP-2 — на 26,2%).

Интерквартильный размах в подгруппах МОФФ был уже, чем в контрольных группах, особенно для IL-4 к 6 месяцу (IQR = 17,9 против 46,6 в контроле), что указывает на меньшую вариабельность ответа и высокую воспроизводимость эффекта терапии. Во всех случаях различия между контрольными и терапевтическими подгруппами были статистически значимы (p < 0,0001). Таким образом, ежедневный прием МОФФ в течение 6 месяцев приводил к выраженной и статистически значимой нормализации всех исследуемых молекулярных маркеров, отражающих процессы воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса при экспериментальной лимфедеме.

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация / научная значимость

Полученные данные представляют собой комплексную молекулярную характеристику патологического процесса при экспериментальной лимфедеме и демонстрируют многоуровневое влияние МОФФ на экспрессию маркеров воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса. Наблюдаемые изменения позволяют не только подтвердить современные концепции патогенеза лимфедемы, но и предложить конкретный фармакологический подход к ее коррекции.

Важно подчеркнуть, что в настоящем исследовании изуча­лась модель вторичной лимфедемы, индуцированной хирургическим повреждением лимфатических узлов. Это соответствует наиболее распространенной клинической ситуации в развитых странах, где лимфедема развивается как осложнение онкологического лечения [1][3][6].

Экспериментальная лимфедема у крыс сопровождается выраженным Th2-опосредованным воспалением и патологическим ремоделированием ВКМ, что полностью согласуется с современной иммуноопосредованной моделью патогенеза лимфедемы. Ключевым наблюдением стало значимое повышение IL-4 более чем в 6 раз в коже пораженной конечности к третьему месяцу без лечения (p < 0,0001 по сравнению с интактным контролем). Этот результат напрямую подтверждает центральную роль CD4⁺ T-клеток и Th2-поляризации в прогрессировании заболевания. Как показали C.L. Ly и соавт. (2019), дифференцировка T-хелперов в Th2-субпопуляцию является необходимым условием для развития лимфедемы в экспериментальных моделях, а блокада этого пути предотвращает заболевание [8]. Недавний обзор C. Bowman и S.G. Rockson подчеркивает, что именно Th2-цитокины (IL-4 и IL-13) выступают в качестве «движущей силы фиброза, адипогенеза и тканевой дисфункции» при хронической лимфедеме [4]. Высокий уровень IL-4 создает условия, при которых регенерация лимфатической сети блокируется, а фиброз прогрессирует — формируется самоподдерживающийся патологический круг, описанный как «порочный цикл лимфедемы» [4][5].

Параллельное повышение MMP-2 более чем в 4,5 раза к 6-му месяцу в коже конечности с лимфедемой по сравнению с интактным контролем (430,0 [ 417,5; 464,8]% vs 94,0 [ 91,0; 100,0]%; p < 0,0001) отражает нарушение целостности базальной мембраны и микроциркуляторного барьера. MMP-2 специфически деградирует коллаген IV типа — основной компонент базальной мембраны капилляров, что приводит к повышению проницаемости сосудов, усилению экссудации белков и усугублению антигенной нагрузки в интерстиции. Это, в свою очередь, поддерживает хроническое воспаление, что согласуется с моделью, описанной R.P. Kataru et al. [3].

Особый интерес представляют данные по маркерам коллагенового обмена. Проколлаген III типа (PIIINP) является маркером активного фиброза, характерного для ранних и средних стадий тканевого ремоделирования. Его чрезмерная экспрессия в коже пораженной конечности к 3-му месяцу превысила уровень интактного контроля более, чем в 7 раз (708,0 [ 685,0; 720,6]% vs 95,0 [ 91,0; 100,0]%; p < 0,0001), что свидетельствует о том, что фибробласты находятся в состоянии постоянной активации, вероятно, под действием TGF-β1 и IL-4. Рост PIIINP к 3 месяцу свидетельствует об интенсивной, но патологической активации фибробластов — типичном признаке раннего фиброза. Статистически значимый уровень PICP, отражающего созревание коллагена I типа, также возрос более чем в 5 раз по сравнению с интактным контролем (512,0 [ 490,0; 534,6]% vs 98,0 [ 95,5; 100,0]%; p < 0,0001), указывая на дискоординированный, неэффективный синтез зрелого коллагена, характерный для хронического фиброза. Эта находка подтверждает, что лимфедема — это не просто отек, а структурная перестройка ткани, о чем также говорят C.Y. Li et al. в обзоре гистопатологических изменений при лимфедеме [6].

Таким образом, одновременное повышение PIIINP и PICP отражает полный спектр фибротической перестройки: от активации фибробластов до формирования зрелого, но патологического коллагенового каркаса [19–21].

Терапия МОФФ привела к значимому снижению всех исследуемых маркеров на всех сроках наблюдения, однако динамика изменений носила нелинейный характер. Наиболее выраженный эффект наблюдался для IL-4: к 6-му месяцу его уровень в группе МОФФ был в 2 раза ниже, чем в соответствующей контрольной подгруппе (210,6 [ 202,5; 220,4]% vs 415,0 [ 394,0; 440,6]%; p < 0,0001), что соответствует снижению на 49,3%. Это указывает на то, что МОФФ воздействует на ранние этапы патологического процесса — Th2-поляризацию. Известно, что флавоноиды (диосмин и гесперидин) ингибируют NF-κB и MAPK-сигнальные пути, что снижает продукцию провоспалительных цитокинов и экспрессию адгезивных молекул на эндотелии. Вероятно, именно этот механизм лежит в основе снижения IL-4.

Снижение MMP-2 на фоне терапии МОФФ было на 26,2% ниже к 6-му месяцу, чем в контрольной группе (317,4 [ 275,0; 320,6]% vs 430,0 [ 417,5; 464,8]%; p < 0,0001), свидетельствует о восстановлении барьерной функции микроциркуляторного русла, что должно приводить к уменьшению экссудации белков и, как следствие, снижению антигенной нагрузки в интерстиции. Это, в свою очередь, ослабляет стимул для активации антигенпредставляющих клеток и T-лимфоцитов — формируется положительная обратная связь в сторону разрешения воспаления.

В исследовании МОФФ значимо снижал оба маркера фиброза: PIIINP (на 36,4%) и PICP (на 39,3%) относительно контроля (340,0 [ 283,6; 390,4]% vs 535,0 [ 456,4; 548,7]% и 250,0 [ 226,1; 297,6]% vs 412,0 [ 345,8; 418,6]%; оба сравнения p < 0,0001). Это позволяет предположить, что препарат не только подавляет активацию фибробластов, но и нормализует архитектонику синтезируемого коллагена. Антифибротический эффект флавоноидов, вероятно, опосредован через подавление TGF-β1/Smad-сигнального пути, что ранее описывалось в моделях легочного и печеночного фиброза.

Следует подчеркнуть, что терапия МОФФ приводила к значимому, но не полному восстановлению уровней маркеров. Это может отражать как ограниченную продолжительность наблюдения, так и необходимость комбинированного подхода (например, с методами физической реабилитации) для достижения полной ремиссии.

Ограничения исследования

К основным ограничениям проведенного исследования относится отсутствие прямой количественной оценки объема отека, что не позволяет провести прямую корреляцию между динамикой молекулярных маркеров и степенью клинических проявлений лимфостаза. Кроме того, терминальный дизайн эксперимента с забором биоматериала в фиксированные сроки (1, 3 и 6 месяцев) не дает возможности отследить непрерывную динамику изменений у одного и того же животного, что требует учета межиндивидуальной вариабельности при интерпретации результатов. Несмотря на указанные методологические особенности, совокупность выявленных молекулярных сдвигов позволяет сделать биологически обоснованный вывод о патогенетическом действии МОФФ. Снижение уровня IL-4 способствует уменьшению капиллярной проницаемости, подавление MMP-2 восстанавливает целостность эндотелия, а ослабление фиброза снижает гидравлическое сопротивление интерстиция, что в комплексе улучшает дренаж жидкости [3][4]. Таким образом, МОФФ действует не как симптоматический агент, а как патогенетическое средство, направленное на разрыв «порочного круга» лимфедемы, что согласуется с терапевтическими принципами, предложенными в современных обзорах [3][4].

Обобщаемость/экстраполяция

Несмотря на то что исследование выполнено на животных, его результаты имеют высокую степень трансляционной релевантности. Использованная модель вторичной лимфедемы у крыс путем резекции лимфоузлов является общепризнанной и воспроизводимой и достоверно имитирует ключевые патофизиологические механизмы заболевания у человека: Th2-опосредованное воспаление, нарушение барьерной функции микроциркуляции и патологический фиброз [1][3][6]. Молекулярные маркеры (IL-4, MMP-2, PIIINP, PICP) идентичны тем, что описаны в био­птатах кожи пациентов с лимфедемой [6][8]. Кроме того, МОФФ (диосмин/гесперидин) — зарегистрированный препарат для применения у человека с доказанным профилем безопасности и фармакокинетикой. Доза 93 мг/сут у крыс была рассчитана по межвидовому коэффициенту и соответствует клинической дозе 1000 мг/сут у взрослого человека³. Однако прямая экстраполяция полученных молекулярных данных на клинические эффекты у человека и тем более определение оптимальных стадий заболевания для применения препарата на данном этапе невозможны. Полученные результаты указывают на необходимость проведения рандомизированных контролируемых клинических исследований для подтверждения терапевтической эффективности МОФФ и определения конкретных клинических показаний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальная лимфедема у крыс сопровождается значимым повышением IL-4, MMP-2, PIIINP и PICP, что отражает Th2-воспаление, нарушение барьерной функции сосудов и патологический фиброз. Динамика этих изменений носит нелинейный характер с пиком экспрессии маркеров к 3-му месяцу наблюдения. Ежедневный прием МОФФ (93 мг/сут) в течение 6 месяцев у крыс с лимфедемой конечности приводит к выраженной и значимой нормализации всех исследуемых маркеров, хотя и не достигает значений интактного контроля. Наблюдаемые молекулярные эффекты: подавление экспрессии маркеров воспаления (IL-4), нормализация показателей барьерной функции (MMP-2) и снижение фиброза (PIIINP, PICP) — свидетельствуют о патогенетическом действии МОФФ на процессы, участвующие в прогрессировании лимфедемы. Примечательно, что терапия МОФФ разобщает патологическую сопряженность между воспалением и фиброзом на индивидуальном уровне, воздействуя на различные звенья патогенеза дифференцированно. Полученные данные подтверждают, что МОФФ способен оказывать влияние на экспрессию молекулярных маркеров, отражающих процессы воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса при лимфедеме, что обосновывает его перспективность в качестве объекта для дальнейших клинических исследований. Для полной коррекции патологических изменений, вероятно, потребуется комбинированный подход, включающий методы физической реабилитации.