Сравнительная оценка системы локального иммунитета у пациенток с вульвовагинальной атрофией: обсервационное когортное исследование

ВВЕДЕНИЕ

Вульвовагинальная атрофия (ВВА), являющаяся центральным компонентом генитоуринарного синдрома менопаузы (ГУСМ), представляет собой хроническое прогрессирующее состояние, развивающееся на фоне дефицита эстрогенов [1]. Патогенез ВВА характеризуется комплексом инволюционных изменений: истончением многослойного плоского эпителия влагалища, снижением содержания гликогена — основного субстрата для лактобацилл, нарушением микроциркуляции и уменьшением продукции защитного слизистого секрета [2][3]. Эти нарушения создают фундамент для дестабилизации вагинальной экосистемы, однако детальный характер перестройки микробиоты и ее комплексное взаимодействие с локальной иммунной системой при ВВА остаются предметом активного изучения [3][4].

Стабильность вагинального микробиоценоза в норме поддерживается сложной сетью взаимодействий между эпителиальными клетками, резидентной микрофлорой и факторами местного иммунитета [5]. Ключевую роль в поддержании гомеостаза играют механизмы врожденного иммунитета. Ведущим звеном является система Toll-подобных рецепторов (TLR), в частности TLR4, который распознает липополисахариды грамотрицательных бактерий [6]. Активация TLR-зависимых сигнальных путей инициирует каскад синтеза провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин 1β (IL-1β), фактор некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкин 18 (IL-18), которые модулируют интенсивность и характер воспалительного ответа [7]. Противовоспалительный цитокин интерлейкин 10 (IL-10) выполняет критически важную функцию негативного регулятора, ограничивая чрезмерную активацию иммунной системы и предотвращая повреждение тканей [8].

Важным элементом врожденной защиты слизистых оболочек являются антимикробные пептиды. Кателицидин (LL-37) — единственный представитель данного семейства у человека — демонстрирует не только широкий спектр прямой антимикробной активности против бактерий, грибов и вирусов, но и обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами, включая хемотаксис иммунных клеток и влияние на процессы ангиогенеза и реэпителизации [9]. На фоне атрофических изменений, нарушающих барьерную функцию, изучение экспрессии LL-37 приобретает особую актуальность.

Для комплексной характеристики иммунного микроокружения целесообразно исследование дополнительных маркеров: транскрипционного фактора GATA3 (ключевой регулятор дифференцировки T-хелперов 2‑го типа, ассоциированных с гуморальным ответом и противовоспалительными реакциями) [10], макрофагального маркера CD68 (отражающего активность фагоцитирующих клеток) [11] и бета-2-микроглобулина (B2M), являющегося обязательным компонентом молекул главного комплекса гистосовместимости I класса и участвующего в презентации антигенов [12].

Традиционные микробиологические методы (микроскопия, посев) не позволяют оценить функциональное состояние локальной иммунной системы. Современным высокоинформативным подходом является интегральная оценка экспрессии мРНК ключевых генов с использованием мультиплексных ПЦР-технологий, таких как тест-система «Иммуноквантэкс». Этот метод предоставляет возможность количественно охарактеризовать профиль иммунной активации, что принципиально важно для углубленного понимания иммунопатогенеза ВВА [13].

Таким образом, учитывая недостаточную изученность взаимодействия между микробиотой и местным иммунитетом при ВВА, комплексное исследование, сочетающее анализ состава микрофлоры и количественной оценки экспрессии генов иммунного ответа, является высокоактуальным.

Цель исследования — изучить взаимосвязь между составом и метаболической активностью вагинальной микробиоты и показателями местного иммунитета, определяемыми по интегральному профилю экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL-1β, IL-10, IL-18, TNF-α, TLR4, GATA3, CD68, B2M) и уровню кателицидина (LL-37) у пациенток с вульвовагинальной атрофией.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Обсервационное когортное исследование проведено с участием 88 пациенток с вульвовагинальной атрофией в менопаузальном периоде, наблюдавшихся амбулаторно, в условиях женских консультаций.

Условия проведения исследования

Сбор жалоб, данных анамнеза и забор биологических материалов для анализов у пациенток с диагнозом «вульвовагинальная атрофия» проводился в период с октября 2021 по октябрь 2022 г. в женских консультациях при государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Родильный дом города Краснодара» Министерства здравоохранения Краснодарского края (ГБУЗ «Роддом г. Краснодара» МЗ КК), Клинике федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Клиника ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России). Лабораторные исследования выполнялись на базе лаборатории ГБУЗ «Роддом г. Краснодара» МЗ КК, кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФГБОУ ВО КубгМУ Минздрава России и лаборатории общества с ограниченной ответственностью «Независимая лаборатория Инвитро» (ООО «Инвитро») г. Краснодара. Анализ полученных результатов исследования произведен на кафедре акушерства, гинекологии и перинатологии № 1 ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России.

Критерии соответствия

Критерии включения

Для всех групп: отсутствие острой соматической и инфекционной патологии, отсутствие аутоиммунной патологии, онкологической патологии и предраковых заболеваний, ожирения 2‑й и 3‑й степени, сахарного диабета 1‑го и 2‑го типа, хронических заболеваний в стадии обострения; отсутствие приема системных и топических антибиотиков и гормональных препаратов, противовирусных, иммуномодулирующих и иммуносупрессивных препаратов, а также вакцин за месяц до забора крови; подписанное пациентом добровольное информированное согласие на участие в исследовании (забор биоматериалов) и использование анамнестических данных.

Для клинических групп: пациентки в менопаузальном периоде длительностью не более 3 лет; впервые выявленная вульвовагинальная атрофия (ВВА) с наличием или отсутствием клинической симптоматики, установленной по критериям индекса вагинального здоровья по Бохман.

Для группы сравнения: условно здоровые пациентки в менопаузальном периоде не более 2-х лет; для группы контроля: условно здоровые пациентки позднего репродуктивного возраста.

Критерии невключения

Для клинических и группы сравнения: несоответствие диагнозу, в том числе выявление при обследовании инфекций, передаваемых половым путем (гонорея, трихомонады, хламидии, микоплазма гениталис), вируса папилломы человека с высокой онкогенностью и цервикальной интраэпителиальной неоплазии, пролапс гениталий 2–4‑й степени по системе POP-Q, отказ пациентки от предоставления письменного добровольного информированного согласия на участие в исследовании.

Для группы контроля: беременность и лактация.

Критерии исключения

Добровольный отказ пациентки от дальнейшего участия в исследовании по любой причине после первоначального включения; выявление во влагалищном и цервикальном содержимом ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium и вирусов (HSV-1,2, CMV, вирус папилломы человека высокого онкогенного риска), начало приема иммуномодуляторов, иммуносупрессоров, гормональных препаратов, антибиотиков, противовирусных препаратов или вакцин в период исследования в связи с острым вновь возникшим заболеванием.

Описание критериев соответствия (диагностические критерии)

Диагноз выставлялся на основании жалоб (зуд, жжение, патологические выделения и т. д.), данных анамнеза и клиническо-лабораторных данных пациентки. Объективная оценка проводилась с помощью визуального осмотра наружных половых органов, влагалищного исследования и вульвоскопии и кольпоскопии для диагностики патологии вульвы, влагалища и шейки матки, микроскопии вагинального содержимого с определением pH секрета, определения индекса вагинального здоровья по G. Bochman (1995) [14], цитологического исследования (ПАП-тест) и определения ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска в соскобе из цервикального канала методом ПЦР. Проводили детальную оценку влагалищной микрофлоры, определение доли лактобактерий и микроорганизмов, ассоциированных с различными патологическими состояниями с помощью тест-системы «Фемофлор®» и оценку локальной воспалительной реакции с помощью тест-системы «Иммуноквантэкс» (ООО «НПО ДНК-Технология»).

Подбор участников в группы

В первоначальном анализе было выявлено 125 женщин. В результате строгого отбора по критериям исключения и невключения в основную группу вошли 88 пациенток. В зависимости от наличия или отсутствия патогномоничных жалоб и клинических признаков ВВА пациентки, включенные в исследование (n = 88), были разделены на две группы: 1‑я группа — пациентки с ВВА и наличием субъективных клинических симптомов и жалоб (n = 42), 2‑я группа — ВВА с визуальными признаками атрофического процесса и отсутствием субъективных клинических симптомов и жалоб (n = 46). Группа контроля (3‑я группа) (n = 50) — здоровые пациентки репродуктивного возраста.

Целевые показатели исследования

Основной показатель исследования

Основным показателем исследования было выявление различий по результатам микроскопии влагалищного мазка, значениям Рh влагалищного содержимого, уровням цитокинов и хемокинов влагалищного секрета (IL-1β, IL-10, IL-18, TNF-α, TLR4, GATA3, cD68) и микробиоме влагалищного биотопа в зависимости от наличия или отсутствия субъективных клинических симптомов и жалоб при ВВА.

Дополнительные показатели исследования

Дополнительные показатели не предусмотрены.

Методы измерения целевых показателей

Для проведения исследования использовались образцы влагалищного отделяемого, взятые тремя стерильными одноразовыми тампонами с заднебоковых стенок влагалища. Материал первого тампона наносился на предметное стекло для скринингового анализа для оценки степени чистоты влагалища (Е. Ф. Кира)¹. Материал второго тампона применялся для определения микробиома влагалища с помощью метода ПЦР в реальном времени, известного как «Фемофлор 16» (разработка ООО «НПО ДНК-Технология»). Содержимое второго тампона использовалось для анализа профиля экспрессии мРНК генов, связанных с иммунным ответом, с применением теста «Иммуноквантэкс». Чтобы предотвратить деградацию РНК, биоматериал помещался в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 500 мкл стабилизирующей среды для РНК (производство ООО «НПО ДНК-Технология»).

Оценка симптомов ВВА проводилась с помощью опросника VSQ (The Vulvovaginal Symptom Questionnaire), состоящего из 21 вопроса, с ответом «да» или «нет»; максимальное количество баллов — 21 [15].

Степень вульвовагинальной атрофии у пациенток оценивали как совокупность 5 показателей: объем, качество и рН влагалищных выделений, состояние эпителия влагалища (увлажненность, эластичность, целостность эпителия, наличие транссудата, влажность). Каждый из параметров оценивается по 5-балльной шкале, затем баллы суммируются. 25 баллов соответствуют нормальному состоянию эпителия влагалища, 20 — незначительной атрофии, 15 баллов и ниже — значительным атрофическим изменениям слизистой влагалища [14]. Дополнительно оценивался индекс созревания (ИС) — процентное соотношение поверхностных, промежуточных и базальных (или парабазальных) клеток в мазке, который указывает на степень пролиферации эпителия. Для его определения подсчитывают 100–200 клеток в 5–8 полях зрения и представляют результат в виде формулы. Слева указывают процент парабазальных (или базальных) клеток, в середине — промежуточных, справа — поверхностных. Если какой-то вид клеток отсутствует, ставится цифра 0. Во время пика эстрогенов, когда увеличивается количество поверхностных клеток, ИС составляет 0/15/85 или 0/10/100, что свидетельствует о выраженной пролиферации многослойного плоского эпителия (МПЭ). Недостаточность эстрогенов проявляется соотношением 65/35/0 (умеренная атрофия) или даже 90/0/0 (выраженная атрофия).

Исследование влагалищного содержимого проводилось с использованием тест-полосок «Кольпо-Тест» (ООО «Биосенсор АН», Россия). Микроскопическое исследование включало высушивание мазка из влагалища и его окраску по Грамму. В мазках определяли наличие эпителия, количество лейкоцитов и эритроцитов, а также виды микрофлоры (кокки, коккобациллы, лактобациллы, кандиды, трихомонады, диплококки и «ключевые» клетки). Мазки классифицировались по четырем степеням чистоты: I степень — не более 2 лейкоцитов в поле зрения, преобладание палочковой флоры (лактобациллы); II степень — 10–15 лейкоцитов в поле зрения, палочковая флора с единичными кокками; III степень — 30–40 лейкоцитов в поле зрения, преобладают кокки, могут присутствовать патогенные микроорганизмы; IV степень — множество лейкоцитов, отсутствие палочек, разнообразие микрофлоры, включая патогенные микроорганизмы (гонококки, трихомонады и другие).

Для оценки микробиома влагалища применялся тест «Фемофлор 16» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), основанный на методе количественной ПЦР в реальном времени. Выделение ДНК осуществлялось с использованием набора реагентов «ДНК-сорб-АМ» (ООО «НекстБио», Россия). Для оценки локальной воспалительной реакции использовался метод ОТ-ПЦР с тестом «Иммуноквантэкс» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). РНК выделялась с помощью набора реагентов «Проба-МЧ-РНК-200S» от этой же компании. В процессе теста «Иммуноквантэкс» после выделения ДНК и РНК проводилась обратная транскрипция для получения мРНК, которая затем амплифицировалась методом ПЦР. По результатам амплификации рассчитывался уровень экспрессии мРНК генов, связанных с врожденным иммунитетом, таких как интерлейкины (IL-1β, IL-10, IL-18, TNF-α), толл-подобные рецепторы (TLR4), транскрипционный фактор GATA3 и ген CD68. В качестве контрольного гена использовался ген β2-микроглобулина. На основании комплексной оценки уровней экспрессии генов автоматически определялось наличие или отсутствие локальной воспалительной реакции с использованием индекса воспаления (ИВ). Значение ИВ менее 50 % свидетельствовало об отсутствии воспаления, более 60 % — о наличии воспаления, а значения в диапазоне 50–60 % обозначались как «нельзя исключить воспаление» (серая зона).

Переменные (предикторы, конфаундеры, модификаторы эффекта)

Факторы, которые могли бы исказить результаты исследования, включали прием антибиотиков и гормональных средств, а также наличие в мазках из влагалища и шейки матки ДНК таких патогенов, как Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, вирусов HSV-1, 2, CMV, вируса папилломы человека высокого онкогенного риска. Кроме того, учитывались случаи выявления предраковых изменений шейки матки (CIN 2 и 3) и рака шейки матки. Для минимизации влияния этих факторов на этапе отбора участников они были включены в список критериев исключения.

Статистические процедуры

Принципы расчета размера выборки

В настоящем исследовании предварительный расчет размера выборки не проводился. Это является ограничением исследования и может влиять на статистическую мощность полученных результатов.

Статистические методы

Для обработки данных применялись специализированные программы: Statistica 6 (StatSoft, США), Microsoft Excel 2010 (Microsoft, США). Нормальность распределения проверялась с помощью теста Шапиро — Уилка. В случае нормального распределения рассчитывались среднее значение (Mean) и стандартное отклонение (SD). Для оценки значимости различий использовались следующие методы: если дисперсии были равны, применялся t-критерий Стьюдента для определения разницы средних и построения 95 % доверительного интервала (ДИ). При отсутствии нормальности данные представлялись в виде медианы и квартилей Ме [Q₁; Q₃], а разница между группами оценивалась через разницу медиан по методу Ходжеса — Лемана с 95 % ДИ. Для проверки значимости применялся U-критерий Манна — Уитни. Сравнение частот категориальных данных проводилось с использованием точного критерия Фишера. Различия считались статистически значимыми при уровне p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки исследования

Согласно протоколу исследования первоначально общая когорта пациенток включала 125 женщин в постменопаузальном периоде длительностью не более 3 лет (по классификации STRAW+10 [16] 1a и 1b стадии). Обязательным критерием было наличие вульвовагинальной атрофии (ВВА). Пациентки, у которых ВВА не была выявлена или обнаружены критерии исключения, в исследование включены не были (исключены 37 пациенток). Окончательно в основную группу вошли 88 человек. Группы сформированы из когорты пациенток, наблюдаемых в женских консультации ГБУЗ «Роддом г. Краснодара» МЗ КК и Клиники ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России. В зависимости от наличия или отсутствия патогномоничных жалоб пациентки стратифицированы на соответствующие группы: 1‑я группа — с наличием жалоб (n = 42), 2‑я группа — выявленная «молчаливая атрофия» (n = 46). Группу контроля составили 50 здоровых пациенток репродуктивного возраста (рис. 1).

Характеристики выборки (групп) исследования

В основную группу были включены женщины, сопоставимые по возрасту (средний возраст 54,2 ± 2,1 года) и по длине постменопаузального периода (в среднем 2,1 ± 0,9 года). Все пациентки основной группы были сексуально активны. Возраст пациенток контрольной группы составил 32,2 ± 4,2 года. В соответствии с критериями включения/исключения тяжелых соматических заболеваний у пациенток основной и контрольной группы отмечено не было.

Основные результаты исследования

Пациентки 1‑й группы при опросе (VSQ) предъявляли следующие жалобы: зуд и жжение в области половых органов — 39/42 (92,9 %); вульводиния — 24/42 (57,1 %); патологические выделения — 35 (83,3 %), неприятный запах, исходящий из вульвы, — 21/42 (50 %), боли при половых контактах — 31/42 (73,8 %); сухость при половом контакте — 38/42 (90,4 %), кровянистые выделения при половом контакте — 19/42 (42,5 %).

По результатам общетерапевтического анализа крови, биохимического и коагулогического исследований у пациенток всех групп не выявлено значимых отклонений от нормы и достоверных различий ни по одному из показателей. Результаты гормонального скрининга у пациенток основной группы не выявили внутригрупповых различий. Так, уровень ФСГ в периферической крови в 1‑й группе составил 44,5 ± 11,8 мМЕд/мл против 48,7±10,2 мМЕд/мл во 2‑й группе, р = 0,376. Эстрадиол (Е2) — 72,3 ± 7,2 пмоль/л в 1‑й группе, 76,3 ± 6,4 пмоль/л во 2‑й группе, р = 0,365. Уровень ФСГ и эстрадиола у пациенток контрольной группы соответствовал возрастным нормам. Уровень пролактина, ТТГ не выходил за пределы референсных норм у всех пациенток основной и контрольной групп. При проведении визуального осмотра в зеркалах и кольпоскопическом исследовании индекс вагинального здоровья (ИВЗ) у пациенток 1‑й группы составил 16,8 ± 2,03 балла, рН влагалищного содержимого — 5,7 ± 0,9, р < 0,001 по сравнению с результатами 2‑й и 3‑й групп. По данным стандартного микроскопического исследования у пациенток 1‑й группы статистически достоверно, по сравнению с результатами 2‑й и 3‑й групп, был увеличен уровень лейкоцитов до 30 в поле зрения, отсутствовали эпителиальные клетки и лактобациллярная флора, микрофлора преимущественно была умеренной и смешанной. По данным цитологии индекс созревания (ИС) — процентное соотношение базальных (или парабазальных), промежуточных и поверхностных клеток составил в среднем (58,5 ± 5,4)/(29,6 ± 4,8)/(2,8 ± 1,2), что соответствовало умеренной атрофии.

Пациентки 2‑й группы патогномоничных жалоб не предъявляли. Однако у пациенток 2‑й группы была выявлены признаки незначительной или умеренной атрофии, индекс вагинального здоровья у них в среднем составил 18,9 ± 2,6 балла, ИС (50,5 ± 2,6)/(25,7 ± 10,3)/(5,6 ± 4,7), что также соответствовало признакам умеренной атрофии («молчаливая атрофия»). Отмечено, что уровень рН влагалищного содержимого у них был ниже и составил 4,9 ± 0,8, р < 0,001 относительно 1‑й группы.

По результатам микроскопического исследования вагинального отделяемого количество лейкоцитов соответствовало нормальным значениям (не более 10–15 в поле зрения), преобладающая флора была скудной, но преимущественно палочковой.

Результаты обследования пациенток 3‑й группы соответствовали возрастным нормам, рН влагалищного содержимого составил 4,3 ± 0,6, ИВЗ — 25, ИС — (0/17 ± 5,5)/(83,6 ± 4,6). Влагалищные мазки характеризовались как «нормоценоз» (по Е. Ф. Кира), который является типичным биотопом влагалища в репродуктивном периоде, в них преобладали лактобактерии, отсутствовали грамотрицательная микрофлора, споры, мицелий и псевдогифы, присутствовали единичные лейкоциты и эпителиальные клетки, соответствующие фазе менструального цикла.

Результаты микробиологического исследования вагинального отделяемого у трех групп пациенток представлены в таблице 1. Таблица содержит результаты микробиологического анализа влагалищного биотопа для пациенток исследуемых групп: 1‑я группа (n = 42), 2‑я группа (n = 46) и 3‑я группа (n = 50). Для каждой группы приведены два ключевых параметра: частота выделения микроорганизмов (в % от числа наблюдений в группе) и количественный показатель (логарифм количества колониеобразующих единиц на миллилитр, lg КОЕ/мл, представленный как M ± SD).

Во всех группах общая бактериальная масса выделялась со 100 % частотой. Однако ее количественный уровень в 1‑й группе (7,1 ± 0,3 lg КОЕ/мл) был достоверно выше, чем во 2‑й (6,1 ± 0,2 lg КОЕ/мл) и контрольной (6,2 ± 0,3 lg КОЕ/мл) группах.

По результатам анализа нормофлоры влагалища (Lactobacillus spp.) выявлены резкие межгрупповые различия. В 1‑й группе лактобациллы обнаружены лишь у 45,2 % обследованных, а их концентрация (2,9 ± 0,2 lg КОЕ/мл) была минимальной. Во 2‑й и контрольной группах лактобациллы выявлялись у 100 % женщин, но их количество в контрольной группе (8,2 ± 0,2 lg КОЕ/мл) существенно превышало таковое во 2‑й группе (4,8 ± 0,1 lg КОЕ/мл), что свидетельствует о состоянии нормоценоза в контрольной группе и умеренном снижении нормофлоры во 2‑й группе.

Семейства Enterobacteriaceae и Staphylococcus spp. (факультативно-анаэробные микроорганизмы) демонстрировали максимальную частоту выделения и количественные показатели в 1‑й группе (35,7 %/5,1 ± 0,1 lg КОЕ/мл и 21,4 %/6,4 ± 0,2 lg КОЕ/мл соответственно). Во 2‑й группе энтеробактерии встречались часто (82,6 %), но в низком титре (2,4 ± 0,1), а в контроле их частота была минимальной (10 %). Streptococcus spp. были наиболее характерны для 1‑й группы (23,8 %/5,6 ± 0,2), в контроле не выявлены.

Ассоциированные с бактериальным вагинозом облигатно-анаэробные микроорганизмы, такие как Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., а также Eubacterium spp., Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp. и Peptostreptococcus spp., показали максимальную частоту и концентрацию в 1‑й группе (например, 100 %/5,2 ± 0,2 для первого комплекса). Это указывает на резкое преобладание анаэробной флоры в данной группе. Другие анаэробы (Sneathia spp. / Leptotrihia spp. / Fusobacterium, Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp., Lachnobacterium spp. / Clostridium spp.) также были преимущественно ассоциированы с 1‑й группой, хотя и с меньшей частотой. Atopobium vaginae был обнаружен исключительно в 1‑й группе (30,9 %).

Микоплазмы: патогенные микоплазмы (Mycoplasma spp.) не были выявлены ни в одной группе. Ureaplasma spp. с наибольшей частотой и концентрацией обнаруживались в 1‑й группе (21,4 %/4,5 ± 0,3).

Дрожжеподобные грибы (Candida spp.): наибольшая частота колонизации отмечена в 1‑й группе (42,8 %), во 2‑й группе она была ниже (13 %), в контрольной группе грибы не выявлены.

Проведенный анализ позволяет охарактеризовать микробиоту следующим образом: 1‑я группа: характеризуется состоянием, соответствующим классической картине бактериального вагиноза. Это подтверждается резким снижением доли и концентрации лактобацилл, значительным увеличением общей бактериальной массы и массивной контаминацией широким спектром факультативных и облигатных анаэробных микроорганизмов в высоких титрах; 2‑я группа: занимает промежуточное положение. На фоне 100 % наличия лактобацилл их уровень снижен. Отмечается высокая частота, но низкий титр некоторых условно-патогенных бактерий (например, Enterobacteriaceae), что может соответствовать состоянию умеренного дисбиоза или аэробного вагинита; 3‑я группа (контроль) демонстрирует картину нормоценоза, для которой характерны доминирование лактобацилл в высокой концентрации и минимальная представленность условно-патогенной микрофлоры.

Сравнительный анализ экспрессии генов иммунного ответа и индекса воспаления эпителия влагалища в исследуемых группах показал, что уровень экспрессии гена интерлейкина 1β (провоспалительный цитокин) был достоверно выше в 1‑й группе по сравнению как со 2‑й (p₁ < 0,001), так и с контрольной группами (p₂ < 0,001). Различий между 2‑й и контрольной группами не выявлено (p₃ = 0,136). Статистически значимых различий в уровне экспрессии генов фактора некроза опухоли α и интерлейкина 18 между всеми тремя группами не установлено (p₁, p₂, p₃ > 0,05) (табл. 3).

Уровень экспрессии гена интерлейкина 10 (противовоспалительный цитокин) был значимо снижен в 1‑й группе по сравнению как со 2‑й (p₁ < 0,001), так и с контрольной группами (p₂ < 0,001). При этом между 2‑й и контрольной группами различий не обнаружено (p₃ > 0,05).

При анализе уровней экспрессии маркеров иммунной активации и регуляции выявлено, что экспрессия гена Toll-подобного рецептора 4 была значительно повышена в 1‑й группе по сравнению со 2‑й и контрольной группами (p₁, p₂ < 0,001). Различий между 2‑й и контрольной группами не выявлено (p₃ > 0,05). Уровень экспрессии гена — транскрипционного фактора GATA3, ассоциированного с Th2-иммунным ответом, был достоверно выше в 1‑й группе по сравнению со 2‑й и контрольной группами (p₁, p₂ < 0,001). Статистически значимых межгрупповых различий в экспрессии гена макрофагального маркера CD68 и гена бета-2-микроглобулина не выявлено. При этом наблюдалось резкое, статистически значимое повышение индекса воспаления в 1‑й группе по сравнению со 2‑й и контрольной группами (p₁, p₂ < 0,001). При этом значения ИВ во 2‑й и контрольной группах значимо не отличались (p₃ = 0,547).

Сравнительный анализ концентрации антимикробного пептида LL-37 в исследуемых группах показал (рис. 2), что концентрация LL-37 в 1‑й группе (59,6 [ 54,5–66,1] пг/мл) была достоверно выше, чем во 2‑й группе (33,2 [ (33,5–35,1)] пг/мл), что подтверждается статистически значимым значением p₁ < 0,001.

Значение показателя в 1‑й группе также статистически значимо превышало уровень в контрольной группе (32,9 [ 30,5–35,1] пг/мл), о чем свидетельствует значение p₂ < 0,001. При этом между 2‑й и контрольной группами статистически значимое различие выявлено не было (p₃ = 0,136).

На представленном точечном графике (scatter plot) (рис. 3) визуализируется взаимосвязь между концентрацией TLR4 (по оси X) и количеством инфекционных агентов (инфектов), обнаруженных в среде влагалища (по оси Y), в исследуемой выборке пациенток с диагнозом «вульвовагинальная атрофия». График предназначен для проверки гипотезы о наличии связи между активацией врожденного иммунитета, опосредованной рецептором TLR4, и степенью микробной контаминации влагалища на фоне атрофических изменений. График демонстрирует сильную положительную корреляцию (r = 0,87) между совокупными показателями.

Дополнительные результаты исследования

Дополнительные результаты в ходе исследования не получены.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Проведенный анализ выявил четкие паттерны иммунной активации, характерные для 1‑й группы. У пациенток этой группы наблюдается выраженный провоспалительный профиль, что подтверждается сочетанным повышением уровня экспрессии провоспалительного цитокина IL-1β, рецептора врожденного иммунитета TLR4 и транскрипционного фактора GATA3 на фоне значимого снижения противовоспалительного IL-10. Ключевым маркером является резко повышенный индекс воспаления, который в 1‑й группе более чем в 5 раз превышает показатели 2‑й и контрольной групп. Во 2‑й группе профиль экспрессии изученных генов и значение ИВ статистически не отличались от таковых в группе контроля, что указывает на отсутствие системного воспалительного ответа в данной группе. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о наличии значительного дисбаланса в иммунном ответе с преобладанием провоспалительной активации исключительно у пациенток 1‑й группы. Проведенный анализ выявил выраженные межгрупповые различия в уровне антимикробного пептида LL-37. Наиболее высокая концентрация пептида зарегистрирована в 1‑й группе, где его уровень был значимо повышен как по сравнению с группой контроля, так и по сравнению со 2‑й группой. Это может указывать на состояние повышенной активации врожденного иммунитета у пациентов 1‑й группы. Во 2‑й группе, напротив, наблюдалась значимо сниженная концентрация LL-37 относительно контрольной группы, что может свидетельствовать о недостаточности врожденного иммунного ответа. Полученные данные подчеркивают различную степень вовлеченности системы антимикробной защиты у пациентов основных подгрупп. Наличие сильной прямой корреляции между уровнем экспрессии Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) и микробной нагрузкой у пациенток с вульвовагинальной атрофией означает, что с увеличением общего количества обнаруженных патогенов или условно-патогенных микроорганизмов концентрации TLR4 (показателя активации иммунной системы) возрастает и такая зависимость является биологически обоснованной, так как TLR4 является одним из ключевых рецепторов, распознающих компоненты бактериальных клеток (например, липополисахариды). Его повышенная экспрессия закономерно может быть ответом на увеличение микробной нагрузки. Выявленная зависимость подчеркивает важную роль врожденного иммунитета в патогенезе вульвовагинальной атрофии. Атрофия слизистой, характеризующаяся истончением эпителия и снижением защитной функции, приводит к повышенной уязвимости для колонизации различными микроорганизмами. В ответ на это происходит активация иммунного звена, в частности повышение уровня TLR4, что и отражает прямая зависимость от количества инфектов. Подобная корреляция может указывать на то, что уровень TLR4 может рассматриваться как потенциальный лабораторный маркер, отражающий тяжесть микробного дисбаланса у пациенток с данным состоянием, и иллюстрирует взаимосвязь между активацией системы врожденного иммунитета (уровень TLR4) и степенью микробной контаминации влагалищной среды при вульвовагинальной атрофии, что вносит вклад в понимание иммунопатогенеза этого состояния.

Ограничения исследования

Результаты настоящего исследования были получены на небольших выборках пациентов. Для дальнейшего развития выполненной работы необходимо проведение исследования с бóльшим объемом выборки. Отсутствие предварительного расчета мощности является ограничением исследования, что необходимо учитывать при интерпретации результатов.

Интерпретация результатов исследования

Полученные в ходе исследования данные позволяют предложить целостную патофизиологическую модель развития симптомной вульвовагинальной атрофии (ВВА), в основе которой лежит триада взаимосвязанных событий: выраженный дисбиоз, нарушение барьерной функции слизистой и дисрегуляция локального иммунного ответа.

Выявленный у пациенток 1‑й группы (с симптомной ВВА) микробиоценоз, характерный для классического бактериального вагиноза — с критическим снижением лактобацилл (45,2 % против 100 % в других группах) и массивной контаминацией разнообразной факультативной и облигатно-анаэробной флорой — создает мощный и постоянный стимул для иммунной системы слизистой. Прямая сильная корреляция (r = 0,87) между уровнем экспрессии TLR4 и общей микробной нагрузкой наглядно демонстрирует, что именно микробный фактор является ключевым драйвером активации врожденного иммунитета. Это полностью согласуется с данными литературы о том, что TLR4 является центральным рецептором, распознающим липополисахариды грамотрицательных бактерий, численность которых при дисбиозе резко возрастает [17].

Ответ иммунной системы у пациенток 1‑й группы носит выраженный провоспалительный характер, что подтверждается значимым повышением уровня IL-1β и подавлением синтеза противовоспалительного IL-10. IL-1β является ключевым провоспалительным цитокином, участвующим в инициации и поддержании воспаления [18][19]. Повышение экспрессии TLR4 демонстрирует активацию рецепторов врожденного иммунитета, распознающих липополисахариды грамм-отрицательных бактерий, что указывает на прямую зависимость иммунного ответа от микробной нагрузки [20][21]. Повышенная экспрессия транскрипционного фактора GATA3 отражает сдвиг в активации Т-клеточного адаптивного иммунитета, способствующего дальнейшему усилению цитокинового воспаления [22]. Одновременно наблюдается статистически достоверное подавление уровня противовоспалительного цитокина IL-10, что усугубляет нарушение иммунного гомеостаза и способствует прогрессированию воспаления [23][24].

Значимое повышение концентрации антимикробного пептида LL-37 в 1‑й группе, вероятно, представляет собой компенсаторную реакцию на высокую микробную нагрузку. Помимо прямой антимикробной активности, LL-37 обладает хемотаксическими и провоспалительными свойствами. Также свидетельствует о механизмах дополнительной защиты врожденного иммунитета в ответ на дисбактериоз и воспаление [25]. LL-37 способствует подавлению роста патогенной флоры и модуляции воспалительного ответа, что отражает попытки организма ограничить распространение воспалительного процесса и предотвратить осложнения [26]. Таким образом, его повышенный уровень может как способствовать контролю над инфекцией, так и усугублять воспалительную реакцию и тканевую деструкцию, характерные для симптомной ВВА.

Важнейшим интегральным показателем является индекс воспаления, который в 1‑й группе достигал 95.5 %, что более чем в 5 раз превышало показатели других групп. Это однозначно свидетельствует о наличии ярко выраженного локального воспалительного процесса, который, по всей видимости, является непосредственной причиной появления клинических симптомов (зуд, жжение, диспареуния, патологические выделения).

В группе пациенток с бессимптомной формой ВВА микробиологический и иммунологический профили не отличались от контрольной группы, несмотря на наличие морфологических признаков атрофии. Этот факт указывает на сохранение иммунологического равновесия и отсутствие значимой провоспалительной реакции, что подтверждает роль дисбиоза как критического триггера клинической симптоматики [27]. Такая «тишина» иммунного ответа при гормональном дефиците может объяснять отсутствие жалоб и создавать основу для консервативного ведения пациенток без необходимости активной иммуномодуляции. Несмотря на наличие атрофических изменений по данным осмотра и цитологии, микробиота характеризуется сохранением лактобацилл (100 %), хотя и в сниженном количестве, а также низкой концентрацией условно-патогенных микроорганизмов. Иммунный профиль этой группы, включая уровень LL-37 и индекс воспаления, статистически не отличался от такового у здоровых женщин репродуктивного возраста. Это позволяет предположить, что для развития клинической симптоматики недостаточно лишь дефицита эстрогенов и сопутствующих атрофических изменений. Ключевым триггером является присоединение тяжелого дисбиоза, который запускает каскад провоспалительных реакций, приводящих к появлению симптомов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование демонстрирует, что ВВА является гетерогенным состоянием, при котором наличие или отсутствие клинической симптоматики напрямую связано с характером вагинальной микробиоты и состоянием локального иммунитета. Ключевым патогенетическим фактором развития симптомной ВВА является не просто дефицит эстрогенов, а формирование выраженного дисбиоза по типу бактериального вагиноза, который запускает мощный провоспалительный ответ. Это подтверждается сочетанным повышением экспрессии провоспалительных маркеров (IL-1β, TLR4), снижением противовоспалительного IL-10 и резким увеличением индекса воспаления >95 %. Уровень TLR4 продемонстрировал сильную прямую корреляцию с микробной нагрузкой, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального лабораторного маркера тяжести дисбиотических нарушений и активности иммунного ответа при ВВА. Антимикробный пептид LL-37 вовлечен в патогенез симптомной ВВА, а его значительное повышение отражает степень активации системы врожденного иммунитета в ответ на микробную контаминацию. Полученные данные подчеркивают важность комплексного подхода, выходящего за рамки исключительно заместительной гормональной терапии. Необходимо обеспечить обязательную оценку состояния вагинального микробиоценоза и локального иммунного статуса. Это позволит не только установить точную причину симптомов, но и дифференцировать тактику ведения пациенток при «молчаливой» форме ВВА. Перспективным направлением дальнейших исследований является изучение динамики иммунных и микробиологических показателей на фоне различных видов терапии ВВА, что позволит оптимизировать подходы к лечению и улучшить качество жизни пациенток в менопаузальном периоде.